黃梁木維管組織細胞激光顯微切割技術體系建立

王雪 龍健梅 董甜甜 鄭丹菁 張立定 彭昌操

摘 要：黃梁木是華南地區重要的速生用材樹種，其快速的次生生長主要取決于包括形成層細胞在內的維管組織細胞的發育進程。為了精準獲取維管組織形成層細胞與高質量RNA，該研究以黃梁木幼苗為材料，通過石蠟切片與激光顯微切割（LMD）結合的方法，成功獲得形成層、木質部和韌皮部細胞。結果表明：優化石蠟切片流程，以卡諾/丙酮作為固定劑（丙酮濃度10%～50%），100%正丁醇作為脫水劑和透明劑，之后經過梯度滲蠟、包埋、切片、脫蠟后可獲得形態完整的組織切片且保證了組織細胞RNA的完整性。調試LMD參數，放大倍數為10×～20×;激光能量為42～44;切割孔徑為4～13;切割速度為16～25;最終獲得的這3種細胞的RNA完整性（RIN）均大于5.0，即形成層細胞RIN=5.0，韌皮部細胞RIN=6.6和木質部細胞RIN=7.9，滿足后續RNA-seq分析。該研究通過優化石蠟切片和LMD參數，成功建立了黃梁木幼苗莖段維管組織細胞的激光顯微切割技術體系，為進一步揭示林木樹種維管組織分裂與分化的調控機制奠定基礎。

關鍵詞：黃梁木，激光顯微切割（LMD），石蠟切片，維管組織，RNA完整性

中圖分類號：Q944.5

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）08-1226-11

Abstract： Neolamarckia cadamba is one of the most important fast-growing trees for wood production in South China， and its secondary growth depends on the development process of vascular tissue cells including formative cells. In order to obtain the vascular tissue accurately and high quality RNA of N. cadamba， we presented an optimal method to provide high-quality paraffin section for vascular tissues， in which carnoy/acetone was used as fixative （acetone concentration was 10%-50%） and 100% n-Butanol was used as the dehydrating and infiltration agent， followed by gradient infiltration paraffin， embedding， sectioning and dewaxing. Meanwhile， LMD parameters were set with magnification between 10× and 20×， power between 42 and 44， aperture between 4 and 13 and speed between 16 and 25 for acquisition of vascular cells in N. cadamba. Utilizing this protocol， high quality of RNAs were extracted， with RIN （RNA integrity number） value of 5.0， 6.6 and 7.9 in cambium cells， phloem cells and xylem cells， respectively. These RNAs can be used for subsequent RNA-seq analysis. Accordingly， the vascular tissue cells capture system by LMD was established in N. cadamba， which would be of value for revealing the regulatory mechanism of vascular tissue division and differentiation in N. cadamba， and provide a reference for capturing vascular cell in other forest tree species.

Key words： Neolamarckia cadamba， laser microdissection （LMD）， paraffin section， vascular tissue， RNA integrity

維管組織由木質部和韌皮部組成，它們在初生生長期間從原形成層產生，在次生生長期間從形成層中不斷產生（Campbell & Turner，2016）。維管系統延伸到整個植物體，提供機械支撐和資源運輸（Zhu et al.，2019）。增殖的形成層細胞是分化木質部（木材）和韌皮部細胞的來源，形成層活性導致莖的增粗和生物量的增加（Elo et al.，2009）。因為大多數植物生物量由形成層產生，所以對形成層的獲得和研究可望進一步了解林木樹種的發育機制并進行生物量遺傳改良。黃梁木（Neolamarckia cadamba）是一種大型落葉速生熱帶樹種，分布在南亞和東南亞。在9 a內平均高度達到17 m，胸徑25 cm（Zayed et al.，2014）。它也是膠合板工業、紙漿和紙張生產的最佳原材料之一。因為黃梁木具有快速增長的特點，所以在1972年的世界林業大會被稱為“奇跡之樹”（Ouyang et al.，2013）。目前對林木速生性狀機理尚不清楚。如何獲得高質量的維管組織特異細胞是了解林木發育機制的前提。因為韌皮部、形成層與木質部組織緊密相連，難以用肉眼精細分離這3種組織，所以需要尋找一種能夠精確分離組織細胞的方法獲得這3種不同類型的維管組織，為林木快速生長機理研究奠定基礎。

激光顯微切割技術（laser microdissection，LMD）是一種從異質細胞群中分離目標細胞的有效技術。在顯微可視化下利用激光直接從組織切片獲得感興趣的細胞，用于隨后對其DNA、RNA和蛋白質的研究（Gousset et al.，2019）。LMD技術最初是為動物組織開發的，但目前通過體系優化在植物應用也較多。LMD常與冷凍切片和石蠟切片相結合，收獲的細胞可以提取DNA、RNA和蛋白質，用于分析來自各種細胞類型的基因組特征、基因表達和蛋白質譜。冷凍切片由于制片流程簡單，可減少RNA損失并提高質量，其與LMD結合已成為一種分離植物細胞并用于RNA-seq分析的常用手段。利用該組合方式已成功分離柑橘表皮組織、挪威云杉韌皮部與木質部不同類型細胞、大麥胚乳細胞等，并獲得適合高通量測序分析的高質量RNA（Matas et al.，2010; Blokhina et al.，2017;Brandt et al.，2018）。然而，冷凍切片因為難以穩定植物組織細胞中的液泡，以及冷凍、解凍可引起組織完整性的喪失，所以使得靶細胞的鑒定變得比較困難（Kerk et al.，2003; Nelson et al.，2006）。石蠟切片能更好地保留細胞結構，故與LMD結合被廣泛應用于草本植物細胞材料分離，如玉米籽粒早期胚乳細胞、擬南芥胚胎表皮細胞、大麥谷粒胚乳傳遞細胞和珠心突起、水稻根部不同類型細胞等的分離（Kaspar et al.，2010;Shiono et al.，2014; Sakai et al.，2018; Zhang et al.，2018）?；贚MD植物組織RNA分離過程的困難一般是植物細胞細胞壁的存在，次生細胞壁的木質化，完全分化的細胞存在大的液泡以及大的細胞間隙（Nakazono et al.，2003; Jyske et al.，2015）。因此，需要保持收獲的組織及細胞具有結構完整性和穩定的細胞內容物，這使得LMD應用于植物細胞，特別是木本植物成為挑戰。目前，LMD結合石蠟切片應用在木本植物的相關報道較少，主要是木本植物的非木質化組織，例如柑橘珠心胚起始細胞、蘋果芽分生組織等（賈慧慧，2016;Verma et al.，2019）。不同物種、同一物種不同組織的LMD體系存在一定的差別，主要體現在切片方式（冷凍切片或石蠟切片）及LMD參數上。因此，為了獲得黃梁木3種不同類型的維管組織（形成層、韌皮部和木質部）及其高質量RNA供后續分析，需要在前人建立的不同植物LMD體系基礎上進一步優化。

本研究主要從固定劑、脫水劑和透明劑等方面優化了黃梁木石蠟切片流程，對LMD的放大倍數、激光能量、切割孔徑和切割速度等參數進行調試，以期獲得黃梁木維管組織3種不同類型的細胞（形成層細胞、韌皮部細胞和木質部細胞）與高質量RNA，建立適合黃梁木維管組織的LMD體系，為后續進行3種不同類型細胞發育的轉錄組分析提供材料，也為進一步挖掘參與黃梁木維管組織發育的關鍵基因，探究林木樹種速生性狀和木材品質遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料黃梁木種子采自華南農業大學校園內10年生黃梁木母樹，成熟種子經無菌水浸泡，于120 r·min-1 的恒溫搖床上40 ℃溫育過夜，之后經75%乙醇中浸泡30 s進行表面滅菌，無菌水沖洗3次后用5%次氯酸鈉浸泡15 min，無菌水中沖洗3次。將經過滅菌處理的種子在無菌濾紙上吸干，并植入MS基礎培養基（Li et al.，2019）。40 d后可獲得第一代小植株，選出其中1棵小植株接種于增殖培養基（MS+0.1 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 6-BA）培養，以獲得遺傳背景一致的植物作為實驗材料。30 d后，切取無性擴繁的幼嫩側芽（含莖段）接種于生根培養基（MS+0.1 mg·L-1 NAA），誘導生根，從而形成完整植株。經過煉苗處理后的植株移栽到浸潤的泥炭土中。待苗高50 cm左右（約4個月），取其第二莖節作為后續實驗材料。

1.2 石蠟切片

1.2.1 固定 取生長旺盛的黃梁木第2莖節，剪除葉片，用鋒利的單面刀片切成2～3 mm的小莖段，單面刀片提前高壓滅菌并用RNaseZap（購自Thermo Fisher Scientific公司）擦拭，去除RNases污染，立即投入含有固定液的15 mL RNA-free 離心管中，固定劑提前預冷備用。固定劑處理見表1。固定后，將每種處理取3個小莖段在通風櫥風干10 min，放入1.5 mL RNA-free離心管，液氮速凍，進行磨樣和RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 脫水 固定后，進行組織脫水處理。脫水劑選用乙醇和正丁醇。根據脫水劑不同所選擇的脫水梯度、脫水溫度以及脫水時間也不同（表2）。根據脫水效果來選用最優的脫水劑及脫水步驟。

1.2.3 透明 脫水后，進行組織透明處理。透明劑種類、透明梯度、透明溫度以及透明時間如表3所示。透明后，將每種處理取3個小莖段在通風櫥風干10 min，放入1.5 mL RNA-free離心管，液氮速凍，進行磨樣和RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.4 滲蠟 滲蠟是石蠟逐步替代透明劑的過程，通過梯度處理和溫度及時間控制，最終石蠟滲透整個組織，為石蠟包埋和后續切片奠定基礎。滲蠟步驟如下：（1）透明劑與石蠟按照1∶1的比例（50%正丁醇/50%石蠟或50%異丙醇/50%石蠟）65 ℃處理1 h;（2）100%的純蠟65 ℃處理1～1.5 h;（3）100%的純蠟65 ℃處理2～2.5 h，2次。

1.2.5 包埋、切片與脫蠟 將含有樣品的石蠟迅速倒入用牛皮紙折疊好的包埋盒內，牛皮紙提前高壓滅菌且用RNaseZap擦拭，去除RNases污染;用干凈且高溫的鑷子將樣品在包埋盒里定位，待石蠟冷卻凝固后，放入4 ℃冰箱保存。用單面刀片將包埋好的蠟塊修成規整的矩形，粘在小木塊上，上機切片，切片厚度14 μm。切片使用到的毛刷、鑷子、刀片等均經過高壓滅菌和RNaseZap擦拭，去除RNases污染;石蠟切片機，烤片機等先用70%乙醇滅菌，再用RNaseZap擦拭。切好的蠟帶放在42 ℃ DEPC水（1%焦炭酸二乙酯）上伸展，用載玻片將蠟帶從DEPC水中取出，平展在玻片上，并放在烤片機42 ℃烘烤，直到水分蒸發完全。將烘干后的組織玻片經過2次二甲苯脫蠟，每次10 min;脫蠟完成后，將組織玻片于通風櫥中至二甲苯完全揮發，并進行形態學觀察。

1.3 激光顯微切割

使用Leica AS LMD 7000對靶細胞進行切割收集，在激光顯微切割前用RNaseZap對承載玻片和收集管的載物臺進行擦拭。對放大倍數（magnification）、激光能量（power）、切割速度（speed）、激光切割孔徑（aperture）、脈沖頻率（pulse frequency）和發射強度（head current）等參數進行調試，建立黃梁木幼苗莖段維管組織細胞最佳切割參數。

2 結果與分析

2.1 不同固定劑處理結果

固定劑的選擇是目標產物獲得的關鍵。本研究選擇3種固定劑對材料進行固定處理，丙酮固定劑處理后的RNA凝膠電泳圖見圖1。由圖1：A可知，RNA有28S、18S兩條帶且無雜帶;而卡諾和FAA處理，RNA無帶，RNA可能完全降解或該處理不能提取出RNA。由圖1：B可知，丙酮固定劑處理后莖段組織形態，組織細胞皺縮嚴重，中間髓部向內凹陷;卡諾處理后邊緣細胞稍微向內皺縮，細胞整體形態較好;FAA處理后，細胞形態與對照組相似。保證固定后組織細胞形態和RNA完整性，是石蠟切片最關鍵的步驟。因此，選擇丙酮為固定劑，分別用70%乙醇和70%卡諾稀釋丙酮，進行后續脫水和透明。

2.2 不同脫水、透明劑組合處理結果

脫水劑是與水能在任何比例下均勻混合的有機溶劑。由于有機溶劑用于交換植物組織中的水，化學脫水也可能損害LMD樣品（Polster et al.，2006）。透明是脫水和浸蠟的橋梁，其作用是使透明劑置換組織中的脫水劑，透明劑是石蠟的溶媒，為后續浸蠟做準備。本研究分別用70%乙醇和70%卡諾稀釋丙酮作為固定劑，乙醇/異丙醇和正丁醇作為2種脫水、透明劑，共4種組合處理（表4）。瓊脂糖凝膠電泳圖結果見圖2。4種組合處理均得到較好質量的RNA。

將4種處理進行后續浸蠟、包埋、切片（14 μm）、漂片、烤片、脫蠟等步驟后，觀察其顯微結構。結果表明，以乙醇/異丙醇作為脫水、透明劑，細胞皺縮較嚴重，髓部出現空洞，且不能清晰識別維管束各細胞，嚴重影響后續激光顯微切割目標細胞的識別與獲取（圖3：A，B）;以正丁醇作為脫水、透明劑，組織細胞相對完整，可清晰識別各細胞類型（圖3：C，D）;其中乙醇/丙酮為固定劑時，髓部出現空洞，不能保證形態學完整 （圖3：C）。

因此，選擇以70%卡諾稀釋丙酮作為固定劑，正丁醇作為脫水、透明劑能得到較好的成片效果，且脫水透明后RNA質量較好，達到激光顯微切割上機前的要求。

2.3 卡諾/丙酮不同配比處理結果

為進一步確定卡諾稀釋丙酮的最適濃度，建立黃梁木幼苗莖段石蠟切片體系，本研究分別用90%、80%、70%、60%、50%、40%的卡諾稀釋丙酮，正丁醇脫水、透明后進行RNA提取及凝膠電泳（圖4），石蠟包埋切片后進行顯微結構觀察（圖5）。

凝膠電泳結果表明，被稀釋后的丙酮（濃度10%～60%）作為固定劑，組織經過脫水、透明后均得到質量較好的RNA（圖4）。由圖5可知，當丙酮體積占比大于卡諾時，切片不完整，髓部出現空洞，細胞皺縮嚴重，不能清晰識別維管束各細胞。因此，丙酮濃度為10%～50%時，經正丁醇脫水、透明后提取RNA質量較好，石蠟切片后細胞形態完整，滿足激光顯微切割上機前的要求。

2.4 激光顯微切割參數調試

根據切片厚度和收集的靶細胞不同，對應的激光參數有較大的改變。經過參數調試，摸索出適合黃梁木形成層、韌皮部和木質部的LMD最佳參數，結果見表5。圖6展示了形成層、韌皮部和木質部切割前，切割路徑和收集管蓋中的細胞顯微結構圖，說明不同類型細胞切割參數不同，其中放大倍數、激光能量和切割孔徑影響最大。特別是形成層細胞壁薄，需在更大物鏡倍數下且嚴格控制激光能量完成切割。

用Rneasy Micro kit（Qiagen）提取微量RNA，用Agilent RNA 6000 Pico Kit檢測RNA的完整性（圖7）。由圖7可知，形成層RIN=5.0，韌皮部RIN=6.6，木質部RIN=7.9。RNA完整性指數 （RNA integrity number）高于5.0的適度降解樣品仍能產生與基因表達譜相匹配的RNA（Romero et al.，2014）。因此，所建立的黃梁木幼苗莖段維管組織細胞激光顯微切割體系得到的目標產物可用于RNA-seq。

3 討論與結論

LMD不需要細胞壁的分解，允許從切片異質組織中分離單個細胞類型，因此特別適合植物加工。該方法允許精確分離少量細胞，可用于研究不同組織或細胞中的基因表達譜。該技術不需要通過任何類型的酶消化分離細胞，不需要細胞特異性報告基因，并且允許在切割前數月存儲固定和包埋組織（Chavan et al.，2018）。根據感興趣的植物組織性質，LMD的樣品制備程序可能會有很大差異?；贚MD的RNA 分離的成功在很大程度上取決于該方法的上游部分，包括組織固定、脫水、浸蠟等（Gautam & Sarkar，2015）。為了盡量減少RNA的降解，在整個過程中盡可能縮短時間，并盡可能保持較低的溫度是至關重要的（Santi，2019）。LMD的整個過程包括3個步驟：（1）樣品處理;（2）顯微切割程序;（3）DNA，RNA或蛋白質提取，測序后進行后續分析。

在進行LMD之前，樣品處理是獲得DNA，RNA或蛋白質良好產量和質量的關鍵步驟。對于樣品處理要注意以下幾點：（1）進行組織切片時，應使用特定試劑清潔所有表面和器械，以去除DNase和RNases。本實驗所用到的特定清潔試劑為RNaseZap，可有效抑制RNases活性。（2）如果使用玻璃容器進行染色或脫蠟，則應在180 ℃下烘烤至少8 h（Santi，2019）。（3）固定是確保高質量RNA產量的最關鍵步驟。真空是一個必要的步驟，以促進固定劑在組織中的滲透;固定劑的體積應至少為樣品體積的五倍（Santi，2019）。（4）完全脫蠟是DNA和RNA提取的必要條件。由于石蠟的去除不充分，可能降低產率。在顯微切割程序過程中還應注意以下幾點：（1）LMD程序不應超過1.5 h，更長的時間會導致目標分子的產率降低（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。（2）當顯微切割的細胞移出收集平臺時，要非常小心地進行，如果收集管帽受到碰撞，樣品可能會丟失。（3）樣品聚焦不當不僅會干擾靶細胞的準確識別，還會妨礙切割過程中激光束聚焦，使靶細胞不能成功捕獲。（4）在低放大率下，激光不夠強大，甚至不夠精確，而高放大率（例如40×）顯著減慢了收集效率。因此，需要對目標組織或細胞進行激光參數調試，不同物種不同組織對應的切割參數不同。（5）可以將含有LMD組織的多個管合并提取RNA，但應在-80 ℃的裂解液中穩定≤1個月（Chavan et al.，2018）。

特別注意的是，固定是確保獲得高質量產量的最關鍵步驟，這取決于固定劑的選擇、滲透時間的長短、溫度和組織大小。材料的固定一方面是使細胞的新陳代謝瞬時停止，保持組織或細胞形態結構的完整性;另一方面穩定細胞內容物及組織中核酸和蛋白質的穩定性（Chavan et al.，2018）。固定劑還能達到使組織變硬從而便于切片，令細胞易于著色的目的，同時具有防腐作用等。然而，固定這個過程會致命地損害用于分析小分子的LMD樣品。因為低分子代謝物可溶于固定的化學試劑中，所以它們可能會在該過程中發生離域并丟失（Schad et al.，2005; Schneider & Hoelscher，2007;Li et al.，2012）。由于普遍存在的RNA酶和蛋白酶，固定劑穿透組織所用的時間越長，RNA或蛋白質降解的可能性就越大。福爾馬林（FAA）可以較好地保持細胞形態，已被廣泛用于組織固定。然而，分子的完整性可能受核酸和蛋白質交聯反應的影響（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。滲透和固定方法的選擇應該是保持組織細節和細胞內容物最大恢復之間的平衡。Kerk et al.（2003）比較了植物組織沉淀和交聯固定方法對來自幾個物種的不同細胞和組織類型中的RNA回收影響。然而，用沉淀固定劑乙醇-乙酸處理的組織中回收到的RNA比用交聯固定劑甲醛-乙酸-乙醇（FAA）處理的細胞中回收到的RNA多2至3倍。這表明大部分細胞RNA通過FAA處理進行交聯或以其他方式可阻礙提取。以卡諾為固定劑的組織細胞大多含有中央大液泡，組織含水量高等特點，例如玉米胚乳細胞、擬南芥胚胎表皮細胞、葡萄葉韌皮部細胞等（Sakai et al.，2018;Zhang et al.，2018; Santi，2019）。分生組織細胞排列緊密，細胞體積小，細胞壁薄，細胞質較濃，沒有中央大液泡，適用于丙酮急劇脫水和滲透處理。以丙酮作為固定劑的主要是植物分生組織，例如蘋果芽分生組織、玉米莖尖分生組織（Verma et al.，2019;Gautam et al.，2019）。本文使用丙酮、卡諾（乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V）、FAA（甲醛∶冰乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90，V/V/V） 3種固定劑對材料進行處理，根據RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳結果，只有丙酮作為固定劑得到了較好質量的RNA。卡諾和FAA均無條帶，RNA完全降解或處理后的材料不易提取出RNA。由于丙酮對組織的脫水性和穿透性較強，經過100%丙酮處理后的組織細胞皺縮嚴重，破壞了組織完整性，影響后續LMD可視化，以及對靶細胞的識別。因此，需要對丙酮加以稀釋，經過乙醇和卡諾稀釋后的丙酮作為固定劑均得到較好質量的RNA。乙醇也是強力脫水劑，可以快速替換出組織中的水分，直接用100%乙醇處理也會使細胞驟然失水發生皺縮。因此，用100%乙醇稀釋丙酮，在相同處理下，卡諾稀釋丙酮會得到更好的形態組織。

關于脫水與透明劑的選擇，正丁醇能與水、乙醇和二甲苯等溶劑混合，是石蠟的溶媒，兼有脫水和透明的作用。相比乙醇梯度脫水和異丙醇再置換出脫水劑，步驟簡單，節約了處理時間。Zhang et al.（2018）研究發現玉米?？梢栽?00%正丁醇中，4 ℃儲存長達9個月而不會損失組織完整性或RNA質量。同時，在65 ℃下進行脫水、透明，高溫促進了試劑更快滲入組織，可為下一步浸蠟做好預熱處理。

LMD精確分離靶細胞，可用于后續高通量數據采集和生物信息學分析。目前基因表達分析通常通過基于微陣列或下一代測序（NGS）技術的全基因組表達譜（全基因組測序、靶向基因組測序、RNA測序和核糖體圖譜分析）進行。LMD與NGS技術的結合是研究細胞和組織特異性過程的有效方法（Abbott et al.，2010;Jyske et al.，2015）。此外，除了轉錄組學和蛋白質組學研究外，代謝物分析正在成為表征特異組織（主要是在植物中）的重要過程（Yi et al.，2012;Fang & Schneider，2014;李勝男等，2020）。目前，對于木本植物維管形成層發生，維管細胞分裂與分化的調控機制有了一定的研究進展（Elo et al.，2009;Campbell & Turner，2016），而LMD應用于木本植物維管組織細胞的研究，可望進一步揭示植物生長發育的調控機制。

本文通過優化石蠟切片流程，調試LMD參數，建立了黃梁木幼苗莖段維管組織細胞的激光顯微切割技術體系，分別獲得形成層、韌皮部和木質部細胞并得到高質量RNA，滿足后續RNA-seq分析。該技術保留了足夠的視覺效果識別感興趣的特定組織或細胞，同時從獲得的靶細胞中最大限度回收到RNA，為LMD結合石蠟切片在其他木本植物上的應用提供了技術參考。

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（責任編輯 何永艷）