沉默miR-26a減輕缺血/再灌注大鼠心肌損傷

宮丹丹，隋春興，石 晨，李 月，姜曉東

(1.大連市中心醫院 心內三科， 遼寧 大連 116033； 2.大連醫科大學附屬第二醫院 重癥醫學科，遼寧 大連 116027)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管疾病死亡的主要原因[1]，冠狀動脈血流恢復(再灌注)和早期經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治療心肌梗死最有效的方法[2]。但是，心肌血流再灌注會導致心肌細胞損傷甚至死亡，主要機制是心肌細胞氧化應激和局部炎性反應增加，這種現象被稱為“缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷”。研究表明，miR-195能夠針對性抑制血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，抑制VEGFA水平可以顯著促進缺血區域的血管生成[3]。目前miR-26a對I/R所致心肌細胞凋亡的影響還未見報道。本研究探討miR-26a基因沉默對I/R心肌功能、心肌細胞凋亡和梗死面積的影響及對Rho/RhoA信號通路蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物：SPF級雄性SD大鼠60只，10～12周齡，質量260 g左右[遼寧長生生物技術有限股份公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001，合格證號：211002300062682]。

1.1.2 試劑：miR-26a siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；反轉錄試劑盒、RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；引物、RT試劑盒熒光定量PCR試劑(Western Biotechnology 公司)；兔多克隆抗caspase-3抗體、鼠單克隆抗Bax抗體、兔多克隆抗RhoA抗體、鼠單克隆抗ROCK1抗體、兔多克隆抗GAPDH抗體、山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：用隨機數表將大鼠隨機分為對照組(n=20)、I/R組(n=20)和siRNA組(n=20)。siRNA組大鼠尾靜脈注射4 mL/kg的miR-26a siRNA。7 d后建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷(I/R)模型，每組大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，并將套管插入左頸動脈測量大鼠血壓。使用雙導聯心電圖儀(electrocardiogram，ECG)監測心率。然后在第四肋間切開胸腔，切除心包暴露心臟。在左心耳上方2 mm處用6-0絲線結扎左前降支冠狀動脈(left anterior descending coronary artery，LAD)，誘導局部心肌缺血。缺血后30 min，絲線松解，再灌注2 h，對照組大鼠同樣進行手術，但未用絲線結扎LAD。再灌注后，處死大鼠，取左室前壁心肌組織于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-26a表達：Trizol試劑提取心肌組織中總RNA，測定總RNA的濃度及純度，A260/280在1.8～2.0提示純度良好，可用于后續實驗。定量后按試劑盒說明反轉錄為cDNA。然后按PCR試劑盒說明進行PCR擴增，采用2-△△Ct法計算miR-26a相對表達水平。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences in RT-qPCR

1.2.3 2,3,5-三苯基四唑氯化物(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色檢測心肌梗死面積：用磨具將新鮮心肌組織切成切片，-20 ℃冷凍30 min。心肌組織切成2 mm厚的切片(每個組織不超過6個切片)。然后將切片放入新鮮的TTC溶液(2%)中孵育不少于0.5 h。0.5 h后取出切片，用4%多聚甲醛固定并拍照。

1.2.4 超聲心動圖檢測大鼠心臟功能：采用Mylab 30 CV超聲系統和10 MHz線性超聲換能器進行超聲心動圖檢查，以檢測各組大鼠的心臟功能。剪掉胸毛后，將大鼠麻醉并放置在37 ℃的加熱板上，左側朝上。然后檢測射血分數(ejection fraction,EF%)、縮短分數(fraction shortening,FS%)和心率(heart rate,HR)。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測心肌細胞病理結構：取心臟組織置于10%甲醛中過夜，脫水后石蠟包埋。所有心肌組織切片5 μm厚，固定于載玻片上，烘干，染色。按照說明書，切片分別用二甲苯、乙醇和蘇木精浸泡，用樹脂密封。干燥后在光鏡下觀察心肌細胞、心肌間質和肌絲的形態。

1.2.6 Western blot檢測Bax、caspase-3、RhoA及ROCK1蛋白表達水平：在溶解緩沖液中充分研磨心肌組織，然后超聲溶解。離心溶解緩沖液，取上清液置于離心管中。采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度，并將蛋白質樣品定量至相同濃度。將蛋白質分裝并置于-80 ℃冰箱中。提取總蛋白質后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將凝膠中的蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在4 ℃下與一抗孵育過夜，然后在黑暗處再次與二抗孵育1 h。設置曝光參數，進行圖片采集。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-26a在心肌組織中的表達

I/R組心肌組織miR-26a表達較對照組顯著上調(P<0.05)。siRNA組梗死區miR-26a的表達水平明顯受到抑制(P<0.05)，表明成功誘導了miR-26a沉默大鼠模型(圖1)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖1 miR-26a在I/R心肌損傷中的表達Fig 1 Expression of miR-26a in myocardial I/R

2.2 超聲心動圖檢查大鼠心功能變化

miR-26a沉默后，I/R引起的心臟結構異常改變明顯改善。此外，miR-26a沉默使I/R損傷大鼠的FS%和EF%顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 miR-26a沉默對心臟病理結構的影響

I/R組心肌細胞明顯水腫，肌絲排列紊亂，有不同程度的降解和壞死，并伴有炎性細胞浸潤。miR-26a沉默后，心肌組織水腫明顯減輕，肌絲異常也明顯改善(圖3)。

圖3 降低miR-26a表達對心臟病理結構的影響Fig 3 Effect of decreased miR-26a expression on cardiac pathological structure

2.4 心肌梗死面積的變化

I/R組心肌梗死面積百分比高于對照組(P<0.05)，siRNA組心肌梗死面積百分比顯著回降(P<0.05)(圖4)。

2.5 心肌細胞凋亡水平

I/R組心肌細胞和成纖維細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，miR-26a沉默后，凋亡心肌細胞數明顯回降(P<0.05)(圖5)。

2.6 心肌組織凋亡相關蛋白的表達

I/R組Bax和caspase-3蛋白表達水平較對照組均明顯升高(P<0.05)，siRNA組與I/R組相比Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)(圖6)。

2.7 miR-26a對心肌Rho/RhoA信號通路蛋白表達的影響

I/R組蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)，siRNA組心肌組織中RhoA和ROCK1的蛋白表達水平顯著低于I/R組(P<0.05)(圖7)。

3 討論

I/R是心肌梗死或心臟手術后心力衰竭的主要原因，其特點是高發病率和死亡率[4]。快速恢復冠狀動脈的正常血供是減少心肌損傷的唯一有效方法，但心臟I/R本身也會導致額外的心肌細胞死亡，進一步擴大心肌梗死面積。導致心肌I/R損傷的因素主要包括氧化應激、炎性反應和凋亡[5-7]。心肌缺血時，心肌細胞會大量消耗三磷酸腺苷從而降低肌漿網吸收Ca2+的能力， 導致線粒體中Ca2+大量積累[8]。心肌細胞I/R過程中，氧重新進入心肌細胞，導致線粒體電子傳遞鏈損傷， 從而增加活性氧(ROS)的產生。線粒體中Ca2+超載和ROS生成會促進線粒體通透性轉換孔的開放，導致細胞能量代謝紊亂，最終導致不可逆的細胞壞死和凋亡[9]。上述結果表明，線粒體作為能量供應的細胞器，是細胞內重要的Ca2+緩沖系統和活性氧產生的主要來源，也是細胞存活和死亡的決定因素。因此，抑制I/R時心肌細胞凋亡、炎性反應和氧化應激，改善心肌線粒體功能，可有效逆轉I/R所致的心功能不全，減少梗死面積。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖2 各組大鼠的心臟組織結構和心功能變化(超聲心動圖)Fig 2 Changes of cardiac tissue structure and function of rats in each

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖4 心肌梗死面積的變化Fig 4 Changes of myocardial infarction area

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖5 心肌細胞凋亡水平比較Fig 5 Comparison of cardiomyocyte

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖6 心肌組織凋亡相關蛋白的表達Fig 6 Expression of apoptosis related proteins in

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是指在生理或病理條件下， 由基因控制的維持體內平衡的程序性死亡[10]。研究表明， 心肌梗死時多種凋亡誘導信號被激活，導致梗死區心肌細胞水腫、凋亡或壞死。心肌梗死后前6 h，心肌細胞主要以壞死的形式死亡，其后以凋亡的形式死亡[11]。在心血管領域，miRNAs被認為是調控生理和病理狀態下心肌應激基因表達的關鍵靶點。根據先前的一項研究，miR-26a在大鼠心臟組織中大量表達，在缺血預處理中有所下降[12]。本研究發現miR-26a在I/R大鼠心肌組織中高表達，沉默miR-26a可顯著改善I/R大鼠的心功能，表現為EF%和FS%均顯著升高。此外，沉默miR-26a可明顯降低I/R大鼠的心肌梗死面積，減少凋亡的心肌細胞數量，降低促凋亡基因Bax和caspase-3的表達。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖7 miR-26a對心肌Rho/RhoA信號通路蛋白表達的影響Fig 7 Effect of miR-26a on the expression of Rho/RhoA signaling pathway in

最后，研究發現miR-26a可以靶向抑制Rho/RhoA信號通路中RhoA及其下游肺內高度表達的效應底物ROCK1的蛋白表達水平，因此沉默miR-26a可以激活Rho/RhoA信號通路。

綜上所述，本研究首次發現，miR-26a沉默可減輕I/R引起的心臟功能障礙和心肌細胞凋亡。