Circ_0038467靶向miR-182調控肺炎鏈球菌(Sp)誘導的人肺泡上皮細胞系HPAEpiC損傷

劉 青，張 蕾，張利元，王世鳳，左立旻*

(電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院 1.急診科； 2.呼吸科； 3.檢驗科； 4.病理科， 四川 成都 611731)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae，Sp)仍然是引起下呼吸道感染的最常見細菌病原體，并且是全世界感染性疾病發(fā)病率和病死率的主要原因，尤其是在兒童和老年人中[1]。肺泡上皮細胞是覆蓋在肺泡上層具有屏障保護作用的細胞，眾所周知，Sp感染引起的肺泡上皮細胞凋亡是肺組織損傷的基礎[2]。因此，闡明肺泡上皮細胞凋亡的調控機制對尋找有效的肺炎治療靶點至關重要。環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一類由外顯子反向剪切形成的共價封閉的環(huán)狀結構RNA分子，其通過與miRNA或RNA集合蛋白作用調節(jié)細胞中多種基因的表達參與包括肺炎在內的許多人類疾病進展[3]。有研究指出，在脂多糖誘導的支氣管上皮細胞損傷中circ_0038467表達增加，circ_0038467敲低顯著抑制細胞凋亡并降低促炎因子產(chǎn)生，是肺炎潛在治療靶點[4]。miR-182是一種炎性相關miRNA，在脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠模型肺組織和支氣管肺泡灌洗液中miR-182表達降低[5]。然而circ_0038467和miR-182在，Sp誘導的肺泡上皮細胞損傷中的作用并不清楚。內質網(wǎng)是維持細胞內環(huán)境平衡的作用細胞器，外界有害刺激持續(xù)存在可破壞內質網(wǎng)的正常功能，導致內質網(wǎng)應激[6]。本研究主要探討了circ_0038467、miR-182對，Sp導的人肺泡上皮細胞系(HPAEpiC)凋亡和內質網(wǎng)應激的影響，分析了circ_0038467對miR-182的靶向調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺泡上皮細胞系(HPAEpiC)和肺炎鏈球菌(Sp)R6(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心)；circ_0038467小干擾RNA、miR-182模擬物(mimics)、miR-182抑制物(anti-miR-182)、circ_0038467過表達載體以及各自對照和雙熒光素酶載體(廣州銳博公司)；Trizol試劑、miScript反轉錄試劑盒、miScript SYBR Green試劑盒、反轉錄酶、SYBR Green PCR master mix(北京天根生化公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染法凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗、兔源重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells，BIP)多克隆抗體、鼠源CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)單克隆抗體、兔源B細胞淋巴瘤(Bcl-2)單克隆抗體、兔源Bcl相關X蛋白(Bax)單克隆抗體、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)單克隆抗體、裂解的caspase-3(cleaved-caspase-3)單克隆抗體和兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(上海碧云天生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及分組處理：用DMEM培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清)培養(yǎng)HPAEpiC細胞，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃、CO2體積分數(shù)5%培養(yǎng)HPAEpiC。細胞匯合度達80%時進行傳代。將對數(shù)期HPAEpiC細胞接種6孔板，細胞單層增殖至90%匯合時用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌R6培養(yǎng)細胞記為SP組[7]。正常對照(NC)組為正常培養(yǎng)的HPAEpiC細胞。Sp+si-NC組、Sp+si-circ_0038467組、Sp+miR-NC組、Sp+miR-182組、Sp+si-circ_0038467+anti-miR-NC組、Sp+si-circ_0038467+anti-miR-182組為在用Sp感染前48 h分別轉染si-NC、si-circ_0038467、miR-NC、miR-182 mimics、si-circ_0038467+anti-miR-NC、si-circ_0038467+ anti-miR-182至HPAEpiC細胞。細胞轉染參照脂質體Lipofectamine 2000使用說明進行。

1.2.2 RT-qPCR檢測circ_0038467和miR-182表達：Trizol試劑提取總RNA。使用反轉錄酶、SYBR Green PCR master mix以GAPDH為內參檢測circ_0038467表達量。使用miScript反轉錄試劑盒和miScript SYBR Green試劑盒以U6為內參檢測miR-182表達量。2-ΔΔCt法表示目的基因相對表達水平。引物序列如下：circ_0038467上游5′-TCCCAGCTG ACCTAAAGTCAAT-3′，下游5′-TGGTGACATTGAGC AGGAAC-3′；GAPDH上游5′-GTCAGCCGCATCTTC TTTTG-3′，下游5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；miR-182上游5′-TTTTAGAGGTTTCGTTAATTTTTT C-3′，下游5′-CTCGATTCGAACCTAAACTCG-3′；U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGAT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTT-3′。

1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡：每組取5×105個HPAEpiC細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后重懸于100 μL結合緩沖液中。加入5 μL的FITC-annexin V孵育細胞10 min，再加入與5 μL的PI暗室內孵育細胞15 min。隨后流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.4 蛋白印跡法(Western blot)檢測內質網(wǎng)應激和凋亡相關蛋白表達：RIPA法提取HPAEpiC細胞總蛋白，二喹啉甲酸法測定總蛋白含量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量變性蛋白，隨后用脫脂牛奶封閉膜后，用1∶1 000稀釋的BIP、CHOP、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3抗體分別孵育膜2 h，再用山羊抗兔二抗孵育膜1 h。化學發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，ImageJ軟件掃描分析吸光度值。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗：合成含有miR-182結合位點的野生型或突變型circ_0038467序列，將其插入pmir-GLO構建成野生型(WT)或突變型(MUT)circ_0038467雙熒光素酶載體，該步驟由上海吉瑪制藥公司完成。用Lipofectamine 2000將WT/MUT-circ_0038467分別與miR-182 mimics、miR-NC共轉染細胞，48 h后測定熒光素酶活性。相對熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值表示。同時將pcDNA-NC、pcDNA-circ_0038467、si-NC、si-circ_0038467分別轉染HPAEpiC細胞，RT-qPCR檢測轉染48 h后miR-182表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 肺炎鏈球菌感染對HPAEpiC細胞中circ_0038467和miR-182表達的影響

與NC組比較，Sp組HPAEpiC細胞中circ_0038467表達量顯著增加(P<0.05)，而miR-182表達量顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 Sp感染對HPAEpiC細胞中circ_0038467和miR-182表達的影響

2.2 抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡及內質網(wǎng)應激的影響

與NC組比較，Sp組HPAEpiC細胞circ_0038467表達量、凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與Sp+si-NC組比較，Sp+si-circ_0038467組HPAEpiC細胞circ_0038467表達量、凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)(表2,圖1～3)。

圖1 抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響Fig 1 Effects of inhibition of circ_0038467 expression on HPAEpiC cell apoptosis induced by Sp

圖2 抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡蛋白的影響Fig 2 Effect of inhibition of circ_0038467 expression on HPAEpiC cell apoptotic proteins induced by Sp

圖3 抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞內質網(wǎng)應激蛋白的影響Fig 3 Effects of inhibition of circ_0038467 expression on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

表2 抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡及內質網(wǎng)應激的影響

2.3 Circ_0038467靶向調控miR-182的表達

生物信息學軟件在線預測顯示，circ_0038467與miR-182存在連續(xù)結合位點(圖4)。雙熒光素酶報告實驗分析circ_0038467和miR-182靶向關系顯示，野生型載體WT-circ_0038467細胞實驗中miR-182組細胞熒光素酶活性較miR-con組顯著降低(P<0.05)(表3)。pcDNA-circ_0038467組細胞中circ_0038467表達量顯著高于pcDNA-NC組(P<0.05)，miR-182表達量顯著低于pcDNA-NC組(P<0.05)；si-circ_0038467組細胞中circ_0038467表達量顯著低于si-NC組(P<0.05)，miR-182表達量顯著高于si-NC組(P<0.05)(表4)。

表3 雙熒光素酶報告基因實驗Table 3 Dual-luciferase reporter

表4 Circ_0038467調控miR-182的表達

圖4 Circ_0038467序列中有miR-182結合序列Fig 4 There was a binding sequence of miR-182 in the circ_0038467 sequence

2.4 轉染miR-182對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡及內質網(wǎng)應激的影響

與Sp+miR-NC組比較，Sp+miR-182組HPAEpiC細胞miR-182表達量顯著升高，凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)(表5,圖5～7)。

表5 轉染miR-182對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡及內質網(wǎng)應激的影響

圖5 轉染miR-182對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of transfection miR-182 on apoptosis of HPAEpiC cell induced by Sp

2.5 干擾miR-182表達逆轉抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞炎凋亡及內質網(wǎng)應激的影響

與Sp+si-circ_0038467+anti-miR-NC組比較，Sp+si-circ_0038467+anti-miR-182組HPAEpiC細胞miR-182表達量顯著降低，凋亡率、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-3、BIP和CHOP蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(表6,圖8～10)。

表6 干擾miR-182表達逆轉抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡及內質網(wǎng)應激的影響

3 討論

CircRNA是近年發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，其異常表達在肺相關疾病、腫瘤中具有重要作用。肺癌組織中hsa_circ_100395表達水平與臨床病理分期、轉移呈負相關[8]。Hsa_circ_0044226高表達參與肺纖維化進展[9]。本研究發(fā)現(xiàn)Sp感染后circ_0038467表達量顯著增加，提示circ_0038467可能與肺炎鏈球菌誘導的HPAEpiC細胞損傷相關。功能缺失實驗顯示，抑制circ_0038467表達顯著減弱Sp誘導的細胞凋亡。Bcl家族蛋白是細胞凋亡通路的關鍵因子，制circ_0038467顯著增加HPAEpiC中Bcl-2表達、降低Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3表達，與抗凋亡作用吻合。內質網(wǎng)主要負責蛋白質折疊和組裝，當嚴重或有害刺激持續(xù)時間過長時導致蛋白質折疊和輸出受到干擾，觸發(fā)內質網(wǎng)應激[11]。本研究中抑制circ_0038467顯著降低內質網(wǎng)應激標志物BIP和CHOP蛋白水平。這些結果表明抑制circ_0038467表達能夠降低Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡和內質網(wǎng)應激。

圖6 轉染miR-182對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡蛋白的影響Fig 6 Effect of transfection miR-182 on apoptotic proteins of HPAEpiC cell induced by Sp

圖7 轉染miR-182對Sp誘導的HPAEpiC細胞內質網(wǎng)應激蛋白的影響Fig 7 Effect of transfection miR-182 on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

Bax表達增加移位線粒體可改變膜通透性，導致促凋亡蛋白釋放，進而觸發(fā)caspase-3蛋白激活誘導細胞凋亡，通過降低Bax表達、增加Bcl-2表達可減弱脂多糖誘導的肺泡上皮細胞凋亡[10]。本研究中抑miRNA是基因表達的關鍵轉錄后調節(jié)因子，其通過與靶mRNA結合抑制其表達在細胞存活、凋亡、炎性反應中發(fā)揮功能。大量研究表明，circRNA通過與miRNA結合進而在基因表達調控中發(fā)揮作用[12-13]。本研究證實miR-182是circ_0038467的下游靶點，且circ_0038467負調控miR-182表達。miR-182在多種器官組織的炎性損傷中發(fā)揮作用。骨髓源性間充質干細胞治療顯著提高LPS誘導的急性肺損傷大鼠模型中miR-182表達水平[14]。miR-182通過抑制Toll樣受體4還可降低LPS誘導的巨噬細胞中促炎因子產(chǎn)生，改善肝臟缺血再灌注損傷[15]。Sp感染后HPAEpiC中miR-182表達量顯著降低，提示miR-182可能對Sp誘導的HPAEpiC細胞損傷發(fā)揮保護作用。功能獲得實驗顯示，轉染miR-182 mimics顯著降低Sp感染后HPAEpiC細胞凋亡率，降低Bax、BIP和CHOP蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達。此外，抑制miR-182表達顯著減弱circ_0038467抑制對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡和內質網(wǎng)應激的保護作用。

圖8 干擾miR-182表達逆轉抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡的影響Fig 8 Effect of interference with miR-182 expression reversed inhibition of circ_0038467 expression on apoptosis of HPAEpiC cell inflammation induced by Sp

圖9 干擾miR-182表達逆轉抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡蛋白的影響Fig 9 Effect of interfering with miR-182 expression reversed inhibition of circ_0038467 expression on apoptotic proteins in HPAEpiC cell inflam- mation induced by Sp

圖10 干擾miR-182表達逆轉抑制circ_0038467表達對Sp誘導的HPAEpiC細胞內質網(wǎng)應激蛋白的影響Fig 10 Effect of interference with miR-182 expression and reverse inhibition of circ_0038467 expression on proteins of endoplasmic reticulum stress in HPAEpiC cell induced by Sp

總之，本研究證實抑制circ_0038467通過靶向調控miR-182表達可減弱Sp誘導的HPAEpiC細胞凋亡和內質網(wǎng)應激。因此，靶向circ_0038467/miR-182可能成為肺炎治療的重要策略。