PTTG和p21作為無功能垂體瘤放射治療預后的分子標志物

李陽芳，胡慧敏*

(1.北京市神經外科研究所，北京 100070； 2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院 神經外科，北京 100070)

垂體瘤(putuitary tumor)起源于顱內腺垂體，是神經外科常見的腫瘤之一，傳統流行病學資料中垂體瘤約占顱內腫瘤的10%～12%，年發病率約為(0.8～1)/10萬，但有報道稱垂體瘤尸檢發現率高達14.4%，隨機人群磁共振影像(magnetic resonance imaging MRI)檢出率為22.5%[1]。 垂體瘤好發于青壯年，較其他顱內腫瘤對人的身心健康更具危害性，對患者的生長、發育、勞動能力、生育功能等都有嚴重影響。無功能垂體腺瘤(non-functional pituitary adenomas,NFPAs)是垂體瘤中的一種，約占垂體瘤的25%，由于NFPAs在發展初期缺乏臨床癥狀，直至生長為大腺瘤才被發現，這時NFPAs多數已侵犯周圍組織呈侵襲性生長，手術難以完全切除并且極易復發[2]，所以結合放射治療(簡稱放療)起到重要的補充作用，但并不是所有的患者都適合放療，非必要的放療易引起患者的垂體功能低下和視神經損傷等，造成二次損傷[3]，所以需要篩選關鍵基因作為分子標志物來預測垂體瘤對放射線的抵抗及敏感。

細胞周期調節因子是DNA損傷修復通路的重要組成部分，正常生理條件下，其能夠調控細胞增殖進程，作用于細胞分裂保持細胞增殖；而放療情況下，由于DNA損傷應答機制的啟動，細胞周期通路開始響應并啟動細胞周期捕獲，參與DNA損傷修復過程，引發放療抵抗[4-5]。本課題利用NFPAs組織芯片對細胞周期依賴性激酶抑制劑1A(cycle-dependent kinase inhibitor 1A,p21)等與細胞周期相關的蛋白進行檢測，結合臨床信息分析影響放療敏感的分子標志物，篩選到垂體瘤轉化基因(pituitary tumor transforming gene,PTTG)和p21 兩個能夠指示垂體瘤對放射線敏感程度的蛋白，作為放療預后的預測分子，并初步評估其在預測NFPAs放療耐受中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

89例無功能垂體瘤樣本取自垂體瘤切除術后的組織標本，來源于北京天壇醫院神經外科研究所垂體瘤樣本庫，所有樣本來源患者均已簽署了知情同意書；本研究獲得首都醫科大學附屬北京天壇醫院倫理委員會批準(KY2019-144-01)。

抗Ki67兔多克隆抗體、 抗PTTG小鼠單克隆抗體、 抗p53 小鼠單克隆抗體、抗p21小鼠單克隆抗體、抗p15兔多克隆抗體、抗p16小鼠單克隆抗體、抗MDM2小鼠單克隆抗體、抗CDK2小鼠單克隆抗體、抗CDK4兔單克隆抗體、抗CCND1兔單克隆抗體、抗CCND3小鼠單克隆抗體、 抗CCNE1小鼠單克隆抗體、抗RB兔單克隆抗體、抗c-Myc小鼠單克隆抗體、抗E2F1兔多克隆抗體和抗E2F4兔單克隆抗體(均英國Abcam 公司)；徠卡免疫組化試劑盒(徠卡生物系統有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 整理患者臨床信息及隨訪資料：包括患者年齡、性別、腫瘤體積、侵襲情況、伽馬刀參數(中心劑量、邊緣劑量和等劑量線)、頭痛、視神經受損及放療引起的激素缺乏癥。患者伽馬刀放射外科治療(gamma knife radiosurgery,GKRS)(簡稱伽馬刀治療)后的1～10年期間進行隨訪，并將磁共振影像作為分組依據，與伽馬刀治療前相比，垂體瘤體積縮小≥20%為放療敏感組，其余為放療耐受組。

1.2.2 組織芯片的制備：根據伽馬刀治療時間2003—2009年的患者樣本為研究組(tissue microarray,TMA-1)；2010—2013年的為驗證組(TMA-2)，所有患者均按照統一標準進行伽馬刀治療。所有樣本用甲醛固定后進行石蠟包埋；在光學顯微鏡下，利用蘇木精和伊紅染色的載玻片選取了每個腫瘤的3個不同區域，然后使用組織芯片儀從石蠟包埋的組織塊中取出3個1.0 mm的蠟芯，并在組織微陣列中隨機排列，確保每個樣本3復孔。使用連續切片機將組織微陣列塊切成4微米的切片，即組織芯片，在-20℃保存至使用。

1.2.3 組織芯片的免疫組化染色：組織芯片均使用徠卡免疫組化自動儀進行組織染色，按照徠卡免疫組化試劑盒說明書進行操作；使用一抗的稀釋比為: 抗Ki67兔多克隆抗體(1∶500)、 抗PTTG小鼠單克隆抗體(1∶500)、 抗p53 小鼠單克隆抗體(1∶800)、 抗p21小鼠單克隆抗體(1∶400)、 抗p15兔多克隆抗體(1∶500)、 抗p16小鼠單克隆抗體(1∶600)、 抗MDM2小鼠單克隆抗體(1∶200)、 抗CDK2小鼠單克隆抗體(1∶50)、抗CDK4兔單克隆抗體(1∶50)、 抗CCND1兔單克隆抗體(1∶6)、 抗CCND3小鼠單克隆抗體(1∶200)、 抗CCNE1小鼠單克隆抗體(1∶100)、 抗RB兔單克隆抗體(1∶600)、 抗c-Myc小鼠單克隆抗體(1∶200)、 抗E2F1兔多克隆抗體(1∶500)、抗E2F4兔單克隆抗體(1∶500)；抗體染色后，所有組織芯片用樹脂黏合劑固定。

1.2.4 組織芯片的判讀：利用徠卡Aeprio AT2掃描系統，掃描組織芯片，核查確定腫瘤區域后，去除雜質及非特異染色區，對組織芯片進行判讀，同時設定核陽性、漿陽性和膜陽性，并對染色深淺進行打分，總分=1×(1分%)+2×(2分%)+3×(3分%)，總分數為0-300區間。CDK4、PTTG和p21在細胞核和胞質中都有表達，所以分別打分。

1.3 統計學分析

2 結果

研究組的樣本共61例，包含27例敏感，34例抵抗；而驗證組為28例，包含12例敏感，16例抵抗。收集病人基本資料及臨床信息列于表1，結果顯示本樣本集群的臨床數據與放療抵抗無顯著關聯。

表1 患者臨床信息與放療抵抗之間的單因素分析

研究組(TMA-1)的 PTTG細胞核和p21細胞質高表達與腫瘤的放療耐受顯著相關(P<0.05和P<0.01)；在驗證組(TMA-2)中，再次印證PTTG細胞核和p21細胞質高表達與腫瘤放療耐受之間的關系(P<0.01)(表2)。

表2 蛋白分子標志物與TMA1和TMA組放療抵抗之間關系的單因素分析

根據組織芯片PTTG細胞核染色評分(0～150)，將PTTG表達情況分為PTTG核陰性(PTTG-nu-)，即無表達；PTTG核陽性(PTTG-nu+)，包括低表達和高表達。同樣，根據p21細胞質染色評分(0～300)，分數為0～149的為p21無表達和低表達(p21-cyL/-)；分數為150～300的為p21高表達(p21-cyH)。PTTG和p21在無功能垂體瘤組織芯片中的蛋白表達情況(圖1)。

在研究組中，PTTG細胞核陰性、p21細胞質無/低表達與腫瘤的放療敏感性高度相關(P<0.01)。驗證組再次證明了上述結果(P<0.05)(圖2)。

3 討論

既往研究主要集中于臨床信息與垂體瘤復發的關系，對于預測垂體瘤放療預后的分子標志物的研究鮮有報道。本研究嘗試利用腫瘤放療后體積的變化來反映垂體瘤對射線的敏感程度，并結合臨床信息和蛋白表達情況，篩選到PTTG和p21兩個能夠預測無功能垂體瘤放療耐受的分子標志物，即細胞核PTTG和細胞質p21表達的升高很可能預示無功能垂體瘤放療耐受。

PTTG是在垂體瘤中發現的原癌基因，同時也是細胞分裂中重要調節蛋白[6]，在細胞核和細胞質均有表達。在直腸癌的研究中，PTTG就是放射耐受的分子標志物，高表達PTTG的直腸癌表現出放療抵抗[7]。體外實驗也證明PTTG的過表達抑制了癌細胞的凋亡，增強了對射線的抵抗力[8]。這點與本研究的結果相一致。PTTG的機制研究顯示，其能夠下調了DNA損傷反應基因，包括p53靶基因BRCA1[9]，甚至與p53相互作用抑制p53活性，與ku70相互作用抑制DNA損傷反應，進而抑制癌細胞凋亡[10]。這從機制上解釋了：PTTG的表達可能阻止了由射線引起的垂體瘤細胞的凋亡。

細胞衰老是輻射后細胞死亡的重要途徑之一。經典的p53/p21信號通路在細胞衰老中起關鍵作用，有報道稱PTTG與p53/p21通路相互作用調節垂體瘤細胞衰老[11]。p21是細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑， 其在亞細胞的定位代表了不同的生物學功能，如核定位顯示增殖抑制和細胞周期檢查點誘導活性，而細胞質定位則顯示抗凋亡和促癌活性[12]。細胞質中的p21能與半胱天冬酶-3酶原(pro-caspase-3)或凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulatting kinase 1,ASK1)聯合作用以阻止細胞凋亡，pro-caspase-3是誘導細胞凋亡的重要基因，而ASK1則激活MAPK通路對細胞凋亡做出反應[13-14]。這從理論上印證了本研究的結果，那就是細胞質高表達p21的NFPAs更能抵御放療引起的細胞凋亡。

Negative, low and high expression of PTTG and p21 in either nuclear or cytoplasm of NFPAs; scale bar=50 μm圖1 PTTG和p21在NFPAs組織芯片(TAM)中表達情況Fig 1 Expression of PTTG and p21 in NFPAs tissue microarray(TAM)

綜上所述，本研究發現NFPAs細胞核PTTG或細胞質p21表達升高的病人更易于引發放療耐受，PTTG和p21可能作為NFPAs預后的預測分子，指導垂體瘤臨床診治；預測分子的發現將進一步闡釋NFPAs放療抵抗的機制，開發針對關鍵基因的藥物對放療耐受進行緩解，增加放射治療敏感度。

A,B.negative nuclear PTTG and low cytoplasmic p21 were significantly related to radiosensitive (P=0.007 6 and 0.003 4, respectively) in the study set; C, D.nuclear PTTG and cytoplasmic p21 level were significantly related to radiosensitive rate (P=0.042 8 and 0.003 5, respectively) in the validation set