兔頸動脈血流灌注減少促進血管內皮細胞炎性反應

生 燕，李秀毛，郭 欣，謝 仟，黃仁杰，生 欣

(遵義醫科大學 基礎醫學院 1.形態學實驗室； 3.生物化學教研室，貴州 遵義 563000;2.遵義醫科大學附屬醫院 胸心外科， 貴州 遵義 563000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎性疾病，炎性反應在其發生、發展過程中發揮重要作用[1]。大量研究顯示血流灌注減少導致的血液流速降低能夠重排內皮細胞骨架進而誘發內皮細胞炎性反應[2-3]。然而，其調控機制還不清楚。平面細胞極性信號通路是調節細胞極性的重要通路[4]，不僅與內皮細胞的炎性密切相關[5]，且其核心蛋白凡客蛋白(Van Gogh protein, VANGL2)和蓬亂蛋白(dishevelled，DVL2)等還能夠介導微管等細胞骨架動力學變化。然而，這兩種蛋白是否參與了血流灌注減少誘導的內皮細胞骨架重排還未見報道。本課題組在細胞水平的研究顯示兩者在不同流速的血流作用下差異表達，本研究進一步在動物水平上探索其與內皮細胞炎性反應以及細胞骨架重排之間的關系，為探究血流灌注改變導致血管炎性反應的機制提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級的新西蘭兔15只，2月齡，體質量(2.0±0.2)kg(重慶醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝)2018-2003])。

1.1.2 試劑：GAPDH 抗體、DVL2 抗體、γ-tubulin抗體、MCP-1 抗體、BBS8 抗體、 VANGL2 抗體以及羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗和兔抗羊二抗等(Proteintech公司)；BCA定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液、Tween-20、PMSF(100 mmol/L)(上海碧云天生物技術有限公司)；PBS干粉、SDS-PAGE配膠試劑盒、高效Ripa組織/細胞快速裂解液、glycine/SDS/Tris(SoLarbio公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司合成)；CLarityTMWestern ECL Substrate(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔的分組及處理：將兔分為對照組、套管組(參考文獻[5]的方法行左側頸動脈套管術建立兔頸動脈狹窄模型，喂以正常飼料)、高脂組(喂以高脂飼料，成分為：5%豬大油、1%白糖、2%膽固醇、0.12%丙基硫氧嘧啶、1%維生素D、0.125%硫酸亞鐵)。

1.2.2 組織的取材：普通飼料適應性飼養1周，以手術后為時間起點，繼續喂養9周后，取套管遠側頸總動脈血管，置于-80 ℃備用。

1.2.3 HE染色檢測內膜:組織經4%多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋，4 μm切片；二甲苯與梯度乙醇脫蠟。蘇木精染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s后自來水浸泡15 min；伊紅液染色2 min；梯度乙醇與二甲苯脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化觀察目的蛋白的定位：參照免疫組化試劑盒說明，切片分別置于二甲苯與梯度乙醇進行脫蠟，在檸檬酸溶液中高壓煮沸兩次，6 min/次。冷卻后， TBST溶液沖洗3次，每次3 min。3%的H2O2溶液中避光封閉過氧化物酶15 min。PBS溶液沖洗3次，每次3 min。100 μL的小鼠免疫蛋白A封閉10 min后甩干。一抗(1∶1 000)10 μL 4 ℃過夜孵育。室溫復溫20 min后， TBST溶液沖洗5 min 3次。試劑B 100 μL 37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。試劑C 100 μL 37 ℃ 酶聯孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色試劑孵育10 min，純水沖洗5 min。蘇木精復染1 min后水沖5 min。1%鹽酸乙醇分化數秒后水沖3 min，梯度乙醇與二甲苯脫水，中性材料樹膠封片。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達：于液氮中磨碎頸總動脈，加入1 mL Trizol裂解液，形成勻漿，參照試劑盒說明進行總RNA提取，微量核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度與純度，-20 ℃儲存用于熒光定量PCR實驗。按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄，獲得的cDNA加入至20 μL反應體系中， 以GAPDH做內參。反轉錄反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃；熒光定量反應條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 min。目的基因的相對表達量通過公式2-△△Ct進行相對定量分析計算。目的基因引物設計(表1)。

表1 Real-time PCR所用引物的序列Table 1 Sequence of primers used in real-time PCR

1.2.6 Western blot檢測目的蛋白的表達：組織于液氮中研磨至粉末狀，分裝離心管內并做好標記。加入100 μL裂解液后，振蕩30 min，5 min/次，4 ℃，1 200 r/min離心20 min，取上清液，16倍稀釋后BCA法測蛋白濃度，按照濃度補加裂解液，再以1∶4比例加入上樣緩沖液(×5)，沸水浴10 min后做好標記置于-2 ℃儲存。

制備凝膠，Marker(蛋白標準)上樣量4 μg，蛋白樣品上樣量10 μg，上樣順序從左至右分別為Marker、正常樣品、高脂組樣品、套管組樣品、Marker。SDS-PAGE電泳后，低溫200 mA電轉120 min，PVDF膜常溫下封閉2 h，TBST洗滌6次，每次5 min。一抗4 ℃過夜孵育，其中，GAPDH 抗體(1∶5 000)，DVL2 抗體(1∶1 000)，γ-tubulin抗體(1∶1 000)，MCP-1 抗體(1∶1 000)， BBS8 抗體(1∶1 000)，VANGL2 抗體(1∶1 000)。TBST洗滌6次，每次5 min。二抗常溫下孵育2 h，其中，羊抗兔IgG(1∶1 000)；羊抗小鼠IgG(1∶1 000)；兔抗羊IgG(1∶1 000)。TBST洗滌6次，每次5 min。ECL曝光顯影，采用Image LabTM軟件對蛋白顯影圖像吸光度值進行分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白吸光度值/內參蛋白GAPDH吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 組織形態學觀察和平面細胞極性信號通路核心蛋白DVL2與VANGL2的表達定位

與對照組相比(圖1A)高脂組胞質分布散在，血管壁完整且輕微增厚，內膜邊界清晰(圖1B)；而套管組胞質分布不均勻，血管壁完整且明顯增厚，內膜增生更為嚴重(圖1C),與對照組相比，套管組內膜與中膜的比值I/M顯著增加(圖1D)。DVL2，VANGL2蛋白的陽性產物主要定位于內膜，對照組無棕黃陽性顆粒(圖2A，A’)，而高脂組與套管組胞質均有棕黃陽性顆粒，且兩組陽性顆粒均主要定位于內膜增生處(圖2B，C，B’，C’)。更為重要的是，套管組內膜增生處的陽性顆粒遠遠多于高脂組。相比，VANGL2來說，DVL2的表達量更多(圖2C，C’，D)。

A-C. HE staining; D.area of intima-to-media; I/M.(intima-to-media ratio) between each group; *P<0.01 compared with control group; scale bar=200 μm; the arrows indicate intimal hyperplasia

A-C.histological localization of DVL2; A’-C’.histological localization of VANGL2; D.DVL2 and VANGL2 expression in each group;bar=200 μm; *P<0.01 compared with high-fat group; #P<0.01 compared with VANGL2 in cannula

2.2 Real-time PCR檢測VANGL2、DVL2、γ-tubulin、MCP-1 mRNA表達

高脂組MCP-1 mRNA表達與對照組無明顯差異，高脂組γ-tubulin與VANGL2 mRNA的表達較對照組上調(P<0.05)，而套管組DVL2、VANGL2、γ-tubulin、MCP-1 mRNA的表達較對照組明顯上調(P<0.01)(圖3，表1)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖3 各組蛋白 mRNA的相對表達量Fig 3 Relative expression of mRNA in each group

2.3 Western blot檢測各組血管中DVL2、VANGL2、BBS8、γ-tubulin與 MCP-1的蛋白表達的影響

高脂和套管組的組織中的MCP-1蛋白表達均高于對照組(P<0.05)，且呈遞增趨勢。此外，平面細胞極性信號通路核心蛋白DVL2與VANGL2，微管組織中心蛋白BBS8，γ-tubulin在套管組的表達也較對照組上調，與MCP-1呈現同步改變(圖4)。

3 討論

在心血管系統中，血管分支和彎曲等部位由于血流灌注減少導致血液流速降低，成為AS發生的高風險區域，即AS發生具有局灶性特征[6]。盡管血流灌注減少作為AS發生的風險因素已經受到了廣泛的認同，但其導致AS血管重建的分子機制仍未闡明。課題組前期對不同流速的血流加載的血管內皮細胞進行轉錄組測序和GO富集分析發現差異表達的基因主要富集到炎性反應等通路， 提示血流灌注減少能夠導致血管內皮細胞炎性反應。在本研究中，通過構建兔頸動脈狹窄模型導致血流灌注減少，結果顯示，高脂飲食和頸動脈狹窄模型動脈中MCP-1表達均高于正常動脈，且動脈狹窄模型中表達最高，表明MCP-1在兩種不同因素導致AS過程中均發揮了作用，且其對于血液流速變化更為敏感。鑒于大量的研究證實MCP-1可通過多種途徑直接參與或影響動脈粥樣硬化慢性炎性反應的多個病理過程[7-9]，因此推測MCP-1參與了動脈狹窄導致的血管炎性反應。

A.immunoblotting images of proteins in each group; B.relative expression of proteins in each group; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group

研究顯示血流灌注減少導致的血液流速降低能夠導致內皮細胞呈現梭型，并發生微絲與微管的重排[10-11]。本研究結果發現作為微管組織中心蛋白的BBS8、γ-tubulin在套管導致的狹窄血管中高表達，且較高脂組和對照組均差異顯著。表明血流灌注減少變化通過調控微管組織中心蛋白改變微管的重排，從而調控細胞結構的變化，最終參與了AS的發生過程，因此，也可能參與了血管灌注減少誘導的血管重建過程。由于平面細胞極性信號通路與AS的發生相關[12]。本研究顯示血液流速的改變不但會導致血管內膜增厚，還會影響該通路的核心蛋白DVL2和VANGL2的表達。形態學與分子生物學檢測均顯示DVL2及VANGL2的在套管組中顯著上調，表明平面細胞極性信號通路通過其核心蛋白DVL2和VANGL2參與了血流灌注減少導致的AS發生。此外，越來越多的研究顯示，細胞骨架的重排與平面細胞極性信號通路密切相關[13-14]，而課題組前期結果顯示在細胞水平上分別干擾DVL2和VANGL2的表達能夠抑制低切應力上調的BBS8和γ-tubulin的表達[15]，表明血流灌注減少通過DVL2和VANGL2調控微管骨架的重排。

此外，盡管血流灌注變化與高脂血癥均是導致AS發生的風險因素，但兩者在AS發生過程中的主次要作用關系還未見報道。在本研究中，盡管高脂組各項指標較對照組有所增加，但較套管組，其變化甚微?？赡艿脑蛟谟?，相比血流灌注減少導致的血管內皮細胞急性炎性反應，高脂血癥在此過程中的作用可能為長期的慢性的炎性反應過程，因此，在AS發生早期，血流灌注改變導致的炎性反應更為明顯。

綜上所述，低切應力作用能夠通過誘導血管MCP-1的上調參與AS早期發生發展，并通過DVL2與VANGL2微管組織中心蛋白BBS8和γ-tubulin調控微管類細胞骨架的重排。