60Co－γ射線誘變創制苦蕎品系的黃酮和蛋白質含量分析

石桃雄，關志秀，韋春玉，李紅興，汪燕，梁成剛

（貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心，貴州 貴陽 550001）

蕎麥是雙子葉蓼科蕎麥屬（FagopyrumMill）植物，包含甜蕎（F．esculentumMoench）與苦蕎［F．tataricum（L.）Gaertn］兩個栽培種［1，2］。蕎麥的種子蛋白質含量較高，且富含蘆丁等黃酮類物質，是我國重要的雜糧作物［1，2］。早在1946年甜蕎種子就被認為是提取蘆丁的優質原料，而苦蕎蘆丁含量一般為甜蕎的3～5倍，保健價值更為突出［3－5］。歷史上苦蕎是彝族人民的主糧，也可作為一種救災填閑作物［6］。苦蕎種子蛋白質以清蛋白和谷蛋白為主，這與水稻等谷物的種子蛋白質組分比例不同，且苦蕎種子蛋白質中賴氨酸含量豐富，比例合理，適宜人體吸收利用［7，8］。近來隨著研究的不斷深入，越來越多的證據表明苦蕎種子黃酮對于“三高”人群的療效顯著，因此，圍繞種子黃酮開展的品質及保健功能研究等較多［8，9］。苦蕎種子多酚成分及比例與水果多酚相似，而與玉米等谷物不同，苦蕎總多酚含量與自由基清除能力呈線性相關［10－12］。目前普遍認為，苦蕎中活性物質不僅對2型糖尿病具有較好的輔助治療效果，還具有較強的清除自由基能力以及抗氧化活性［8－14］。隨著生活水平的日益提高以及人們對苦蕎營養與保健功效的認識，苦蕎產品越來越受到廣大消費者的追捧。

目前，苦蕎雜交育種工作開展緩慢，主栽品種大多是以常規育種方法育成［15］。輻射誘變育種是苦蕎高產優質育種較為常用的方法之一［16］。晉蕎麥2號是原山西省農業科學院選育的高產優質國審苦蕎品種［17］。對晉蕎麥2號進行引種發現，在貴州地區晉蕎麥2號不僅表現出高產、穩產特性，而且具有總黃酮含量較高等特性［18］。此外，低氮與低磷處理發現，晉蕎麥2號為耐低氮、磷高效品種［7，19］。因此，本課題組以晉蕎麥2號為材料進行60Co－γ射線輻射誘變，創制突變種質資源，以期為下一步苦蕎的高產優質育種以及基因功能研究提供材料。本研究即選用其中單株產量較高的株系為材料，對其種子的主要營養與保健成分進行檢測，為今后苦蕎的優質育種以及產品加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年以晉蕎麥2號為材料，使用60Co－γ射線（200、400、600 Gy）對30 000余粒種子進行輻射誘變。本試驗即以誘變創制的49份具有高產潛力的M6代種子為材料，以野生型晉蕎麥2號（JQ2）為對照。供試材料見表1。

表1 供試材料及編號

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 將各品系種子分為3份，置于60℃烘箱中烘干，冷卻后去殼，并用粉碎機粉碎，過100目篩，供品質指標測定使用。

1.2.2 總黃酮與總多酚含量的測定 稱取0.05 g樣品于2 mL離心管中，加入80%的乙醇1.5 mL并振蕩搖勻，在70℃下浸取5 h（期間振蕩搖勻5次），再利用超聲提取10 min，最后在2 000 r／min下離心2 min，取上清液，待測。總黃酮的測定參考汪燕等［7］的方法，以蘆丁標準溶液制作標準曲線進行計算；總多酚含量的測定參考孫丹等［20］的方法，以沒食子酸標準溶液制作標準曲線進行計算。

1.2.3 蛋白質組分的測定 參考汪燕等［7］的方法，稱取0.10 g樣品置于瓷研缽中，依次加入清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白提取液進行提取并測定。

1.3 數據分析

使用Microsoft Excel 2010進行數據整理，用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 苦蕎種子總黃酮含量的分析

由表2可知，49份苦蕎材料的種子總黃酮含量在7.55～32.05 mg／g間，平均為20.52 mg／g總黃酮含量高于20.00 mg／g的材料有32份，低于10.00 mg／g的材料有7份，顯著或極顯著高于對照的材料有19份，極顯著低于對照的材料有13份。其中，LW－16和LW－76的總黃酮含量達到30.00 mg／g以上，為高黃酮含量苦蕎材料較對照分別提高52.28%和52.47%；LW－69的總黃酮含量為7.55 mg／g，為低黃酮含量苦蕎材料，較對照降低64.09%。

表2 苦蕎種子的總黃酮含量 （mg／g）

。

，

2.2 苦蕎種子總多酚含量的分析

由表3可知，49份苦蕎材料的種子總多酚含量在4.55～11.76 mg／g之間，平均含量為8.21 mg／g。總多酚含量為10.00 mg／g及以上的材料有4份，低于5.00 mg／g的材料有1份，含量顯著或極顯著高于對照的材料有4份，顯著或極顯著低于對照的材料有7份。其中LW－52和LW－57為高多酚苦蕎材料，總多酚含量達到11 mg／g以上，較對照分別提高35.50%和39.17%；LW－16總多酚含量為4.55 mg／g，為低多酚苦蕎材料，較對照降低46.15%。

表3 苦蕎種子的總多酚含量 （mg／g）

2.3 苦蕎種子蛋白質組分含量的分析

由表4可知，49份苦蕎種子總蛋白含量在55.51～116.08 mg／g之間，平均88.85 mg／g。其中，LW－57和LW－17種子總蛋白含量分別為116.08 mg／g和110.38 mg／g，較對照分別提高20.34%和14.43%，達顯著或極顯著水平；12份材料的種子總蛋白含量顯著或極顯著低于對照，LW－25和LW－46為低蛋白含量苦蕎材料，種子總蛋白含量分別為55.51 mg／g和58.49 mg／g，分別較對照降低42.45%和39.36%。

表4 苦蕎種子的總蛋白含量 （mg／g）

由表5可知，49份苦蕎材料的清蛋白含量在3.24～67.04 mg／g間，變異系數達到31.14%，平均含量為43.31 mg／g，占總蛋白含量的48.75%。其中，LW－25種子的清蛋白含量最低，較對照降低91.63%；LW－37種子的清蛋白含量最高，較對照提高73.29%。

表5 苦蕎種子的蛋白質組分含量及比例

49份苦蕎材料的球蛋白含量在0.37～6.40 mg／g間，變異系數達到54.08%，平均含量為2.38 mg／g，占總蛋白含量的2.68%。其中，LW－25種子的球蛋白含量最低，較對照降低90.05%；LW－59種子的球蛋白含量最高，較對照提高72.04%。

49份苦蕎材料的醇溶蛋白含量在1.42～6.75 mg／g間，平均含量為3.66 mg／g，變異系數達到25.18%。其中，LW－42種子的醇溶蛋白含量最低，較對照降低78.91%；LW－76種子的醇溶蛋白含量最高，較對照提高0.25%。

49份苦蕎材料的谷蛋白含量在25.59～63.32 mg／g間，平均含量為39.50 mg／g，變異系數達到25.54%。其中，LW－42種子的谷蛋白含量最低，較對照降低45.93%；LW－17種子的谷蛋白含量最高，較對照提高33.80%。

2.4 苦蕎種子主要營養與保健成分的相關性分析

對苦蕎種子主要營養與保健成分含量進行相關性分析，結果（表6）發現，苦蕎種子總多酚含量與清蛋白含量（0.347**）和總蛋白含量（0.322**）呈極顯著正相關；總黃酮含量與醇溶蛋白含量（0.226**）和谷蛋白含量（0.178*）呈極顯著和顯著正相關，與球蛋白含量（－0.445**）呈極顯著負相關；清蛋白含量與總蛋白含量（0.714**）呈極顯著正相關，與谷蛋白含量（－0.282**）呈極顯著負相關；醇溶蛋白含量與谷蛋白含量（0.243**）和總蛋白含量（0.162*）呈極顯著或顯著正相關；谷蛋白含量與總蛋白含量（0.462**）呈極顯著正相關。

表6 苦蕎種子總黃酮、多酚和蛋白質組分的相關性分析

3 討論與結論

苦蕎種子富含黃酮類生物活性成分，不僅具有降血糖、降血壓、降血脂等顯著療效，在清除自由基能力以及抗氧化等方面也具有明顯效果［8－14］。呂丹等［21］研究表明，212份苦蕎種質總黃酮的含量范圍為1.02%～2.84%，平均值為2.05%。本研究發現輻射誘變對苦蕎種子總黃酮含量影響較大，49份苦蕎材料的總黃酮含量在7.55～32.05 mg／g間，與野生型晉蕎麥2號比，19份材料種子總黃酮含量顯著或極顯著提高，13份材料極顯著降低。其中，LW－16和LW－76為高黃酮含量苦蕎材料，LW－69為低黃酮含量苦蕎材料，可作為優質育種或次生代謝研究的重要材料。

苦蕎種子多酚含量與抗氧化活性密切相關，苦蕎多酚不僅能改善內皮胰島素抵抗，另外其游離酚提取物還能顯著抑制人結腸癌細胞增殖［10－12］。本研究發現，輻射誘變對苦蕎種子多酚含量影響較大，49份材料的總多酚含量在4.55～11.76 mg／g之間，顯著或極顯著高于對照的有4份，顯著或極顯著低于對照的有7份。其中LW－52和LW－57為高多酚品系，可作為苦蕎優質育種的重要候選材料。

苦蕎蛋白質含量較高，氨基酸比例均衡，營養價值高，適宜人體吸收利用［22］。除此之外，Zhang等［13］研究發現苦蕎蛋白還具有降血脂等保健功效。李紅梅［14］和汪燕［7］等研究發現苦蕎種子蛋白質組分以清蛋白與谷蛋白為主，本研究也發現苦蕎種子蛋白質組分中清蛋白與谷蛋白含量最高。體外抗氧化能力研究發現，苦蕎種子蛋白質組分中清蛋白和球蛋白具有抑制超氧陰離子自由基產生和清除羥自由基等功效［14］。不過，苦蕎種子球蛋白含量較低，平均為總蛋白的2.68%，因此，選育高清蛋白含量品種可作為苦蕎優質育種的重要目標。本研究發現，LW－37種子清蛋白含量達到67.04 mg／g，較對照提高73.29%，可作為苦蕎優質育種的重要候選材料。

苦蕎是我國重要的雜糧作物，其種子富含蛋白質以及蘆丁等黃酮類物質，具有較高的營養保健價值和食療功效［5，6］。苦蕎優質育種非常重視種子中蛋白質、總黃酮含量等指標。苯丙氨酸不僅是合成蛋白質的重要氨基酸，也是黃酮類次生代謝物的主要前體物質［23］。相關性分析結果表明，苦蕎總蛋白、清蛋白含量與總多酚含量呈極顯著正相關，谷蛋白、醇溶蛋白含量與總黃酮含量呈顯著或極顯著正相關，說明選育兼具高蛋白、高黃酮和高多酚含量的苦蕎品種具有可能性。

受限于苦蕎花朵小、雜交工作開展較難等因素，苦蕎雜交優質育種研究進展較為緩慢［15，16］。本研究利用60Co－γ射線對苦蕎進行輻射誘變，發現49份材料種子總黃酮含量的變異系數達到35.52%，總多酚含量的變異系數達到19.27%，總蛋白含量的變異系數達到16.24%，說明60Coγ射線輻射誘變可為苦蕎優質育種的有效途徑；而且60Co－γ射線輻射創制的營養成分含量發生極端變化的材料，如LW－25為低清蛋白和球蛋白材料，可為苦蕎的基因功能研究提供材料。