用電壓鉗檢測煙堿型乙酰膽堿受體導電孔道的重要位點

薛奮勤，李 華，劉麗娜，許 晴，薛 冰，魏 華

(首都醫科大學 中心實驗室, 北京 100069)

煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)屬于配體門控離子通道中半胱氨酸環受體家族的一員，廣泛分布于哺乳動物的大腦中。其中α7 nAChR是中樞神經系統中的一個主要受體,對鈣離子有很高的通透性[1]，在興奮性突觸傳遞、遞質釋放和神經突生長等神經元活動中發揮著重要作用[1-2]。

α7 nAChR由5個相同亞基組成,每個亞基均有一個胞外結構域(N端)，4個跨膜區段(M1-M4)和1個胞內環。每個亞基的跨膜區段M2借助于疏水作用力參與了受體導電孔道的形成。神經遞質或激動劑與結合位點結合后會誘導受體構象變化，該變化傳播到跨膜區段進而將孔道打開[3]；但是隨著受體長時間與神經遞質的結合，導電孔道又會關閉，即所謂的脫敏，脫敏會調控突觸的傳遞過程[4]。所以研究α7 nAChR導電孔道的主要控制位點對于解析通道的激活機理及突觸傳遞有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性非洲爪蟾(杭州爪蟾資源中心)；人α7 nAChR亞基的cDNA及卵母細胞表達的載體pGEMHE(本實驗室保存)；基因定點突變試劑盒(Stratagene公司)；麻醉劑MS-222(Sigma-Aldrich公司)；其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 α7 nAChR亞基結構模型的構建及跨膜區段M2的位置：以蛋白質數據庫(Protein Data Bank)中電魚(torpedo)的煙堿受體(代碼為2BG9)A鏈為基準，采用Discovery Studio軟件先將α7 nAChR亞基與之進行序列比對，然后以A鏈為模板由軟件構建α7 nAChR亞基的三維結構模型。用Pymol軟件顯示α7 nAChR亞基的結構模型并展示其跨膜區段M2的位置。

1.2.2 測定α7 nAChR亞基的M2各個突變體對ACh的敏感性：基于PCR的定點突變方法將編碼人α7 nAChR亞基M2區段的所有氨基酸(Leu248-Ala258)逐個突變成親水性氨基酸絲氨酸，然后通過cDNA質粒體外轉錄的方法，以表達α7 nAChR亞基M2突變體制備cRNA，再將cRNA注射到非洲爪蟾卵母細胞中以表達α7nAChR亞基M2突變體，注射1～3 d后，室溫下(22 ℃)用雙電極電壓鉗記錄卵母細胞膜電流。詳情參考文獻[5-6]。

用系列濃度的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)灌流已注射cRNA的卵母細胞，測定其膜電流值，計算受體及突變體對ACh的半效應濃度值(median effective concentration,EC50)，通過對EC50的比較，分析各突變體對ACh的敏感性差異。

1.2.3 測定α7 nAChR亞基的M2突變體對ACh的脫敏程度: 與野生型(wild type，WT)相比,將對ACh敏感性顯著降低的突變體cRNA注射到爪蟾卵母細胞中，注射1～3 d后用飽和濃度的ACh刺激并記錄卵母細胞膜電流，對突變體的脫敏曲線進行擬合，得到各突變體脫敏的時間常數(τ值)。

1.2.4 α7 nAChR亞基的M2突變體對ACh的敏感性與脫敏程度的相關性分析:將α7 nAChR亞基的M2突變體對ACh的EC50和脫敏τ值的1/τ取對數，對log(EC50)和log(1/τ)進行線性回歸分析，研究突變體對ACh的敏感性和脫敏程度的相關性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 α7 nAChR亞基結構模型的構建及跨膜區段M2的位置

α7 nAChR亞基主要由胞外結構域(N端)、偶聯區、4個跨膜區段(M1-M4)，以及位于跨膜區段M3和M4之間的胞內環組成(圖1)。其中跨膜區段M2借助于疏水作用力參與了受體導電孔道的形成。

A.structure of α7 nAChR subunit and its related domains；B.transmembrane region M2 of α7 nAChR subunit is involved in the formation of ion-conducting pore of the receptor by the hydrophobic force圖1 α7 nAChR三維結構模型及跨膜區段M2的位置Fig 1 Location of the transmembrane segment M2 in the three-dimensional structural model of α7 nAChR

2.2 測定α7 nAChR亞基的M2各個突變體對ACh的敏感性

α7 nAChR亞基跨膜區段M2的突變體L248S、V252S、L255S和L256S對ACh的EC50值減少得最多，超過20倍(表1)。與WT相比，4個親水性突變導致劑量-反應曲線向左顯著移動(圖2)。

圖2 α7 nAChR野生型及其突變體對乙酰膽堿的劑量-反應曲線Fig 2 Dose-response curve of wild type and its mutantsof α7 nAChR against the agonist acetylcholine

表1 用雙電極電壓鉗測定各突變體的EC50值

2.3 測定α7 nAChR亞基的M2各個突變體對ACh的脫敏程度

M2區的4個突變體(L248S、V252S、L255S和L256S)在爪蟾卵母細胞表達后，用飽和濃度的ACh來刺激這些突變體。結果顯示，與WT相比，4個突變體的脫敏程度均顯著降低(圖3)。

τ(WT)=0.17±0.04 s, n=6；τ(L248S)=180.00±5.28 s and τ(V252S)=300.00±12.65 s, n=4, P<0.001; τ(L255S)=8.09±0.47 s and τ(L256S)=6.98±0.71 s, n=4, P<0.01

2.4 α7 nAChR亞基的M2各個突變體對ACh敏感性與脫敏程度的相關性分析

M2區突變體對ACh敏感性和脫敏程度呈正相關性(圖4)。

圖4 α7 nAChR野生型和突變體對乙酰膽堿的敏感性與脫敏程度相關性Fig 4 Sensitivity of wild type α7 nAChR and its mutants to acetylcholine was positively correlated with the degree of desensitization(R2=0.98)

3 討論

在本研究中，采用定點突變和雙電極電壓鉗的方法，檢測了組成人α7 nAChR導電孔道的主要氨基酸位點。研究發現，當對位于該受體M2跨膜區段的4個位點(L248、V252、L255和L256)進行親水性突變后，它們對激動劑ACh的敏感性提高， 即增加了離子通道受體的開放概率。同時還發現，這4個親水性突變體對ACh的脫敏程度降低，即這些離子突變體的離子通道一旦打開便不易關閉。綜上，這些結果表明位于M2跨膜區段的L248、V252、L255和L256位點對于離子通道的開放起著決定性作用，是組成α7 nAChR受體導電孔道的主要氨基酸位點。

乙酰膽堿受體包括毒蕈堿型乙酰膽堿受體和煙堿型乙酰膽堿受體，它在中樞和外周神經系統中均發揮著重要作用。其中，α7 nAChR是由5個相同亞基組成的五聚體，對鈣離子的通透性高，對鈣離子的濃度調控及神經遞質的釋放起著重要作用[7]。α7 nAChR與阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥及癲癇等發病有著十分密切的聯系[4]。

nAChR的激活過程涉及到受體的多個結構域。當激動劑結合到位于nAChR胞外端的結合位點后，該區域即發生構象變化。隨后，這些構象變化要通過處于胞外端和跨膜區段的耦合區段才能傳遞到導電孔道，從而使通道打開。在這個過程中，多個結構域，包括胞外端、loop7、loop2、M1和M2-M3連接區段及導電孔道等，都參與了構象變化的傳遞，最終使受體通道激活[8]。

目前，nAChR激活的結構學機理還不完全清楚。盡管前人的研究表明在受體通道的激活過程中多個結構域發生了構象變化，但是構象變化怎樣從胞外端傳遞到導電孔道還不完全清楚。其中一個基本的問題是在構象發生變化的結構域中哪些氨基酸起著重要作用[9]。在本研究中，通過定點突變和雙電極電壓鉗的方法，發現位于受體M2跨膜區段的L248、V252、L256和L255是組成α7 nAChR導電孔道的主要氨基酸位點。該研究對于研究nAChR的激活及脫敏的結構學機理起著重要的基礎作用。