鼠李糖乳桿菌通過調(diào)節(jié)腸道微生物群緩解造血干細(xì)胞移植后肝臟移植物抗宿主病

房 婷，李 響，劉 潔，王 皓

(中國(guó)人民解放軍第960醫(yī)院 1.血液病科； 4.普外科，山東 濟(jì)南 250031； 2.中國(guó)人民解放軍93381部隊(duì)醫(yī)院，黑龍江 五常 150223； 3.常州市第二人民醫(yī)院 血液內(nèi)科，江蘇 常州 213000)

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后的主要并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也是導(dǎo)致非復(fù)發(fā)死亡的重要原因[1]。它主要累及皮膚、肝臟、腎臟和消化道等，其中肝臟是除皮膚之外最常受累的靶器官[2]。腸道微生物群在HSCT后GVHD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明，GVHD小鼠中微生物群落多樣性降低，且與GVHD嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[3]。GVHD發(fā)生時(shí)腸道微生物多樣化水平降低，口服乳酸桿菌能夠減輕GVHD癥狀及相關(guān)死亡率[4]。鼠李糖乳桿菌GG菌株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG)從屬于乳桿菌屬，是從人腸道中分離而得的重要益生菌。近年來，研究證明LGG能夠耐受消化道環(huán)境，并且能夠在腸道內(nèi)定植，起到調(diào)節(jié)腸道微生物群的作用[5-6]。然而LGG對(duì)HSCT后GVHD肝臟損傷影響的研究還較少。本研究以GVHD小鼠為研究對(duì)象，研究了LGG對(duì)GVHD肝臟損傷的影響，為GVHD的臨床干預(yù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量22～25 g為供鼠，相同特征的BALB/C小鼠為受鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)。

1.1.2 主要試劑：鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusCICC No.6001，凍干粉，中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院)；ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；蘇木精和伊紅(HE)溶液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；糞便DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：GVHD組和LGG組小鼠在移植前1周飲用含抗生素的飲用水(32萬U/L慶大霉素及0.25 g/L頭孢曲松鈉)。在移植前4 h，接受60Co(cobalt-60) γ射線全身照射7.5 Gy，劑量率為0.67 Gy/min。將供體C57BL/6小鼠處死后在超凈工作臺(tái)上取脛、股骨骨髓及脾臟，制備骨髓細(xì)胞(5×106個(gè))和脾細(xì)胞(1×106個(gè))的單細(xì)胞懸液。通過尾靜脈回輸BALB/C受體小鼠誘導(dǎo)GVHD。骨髓移植后，LGG組小鼠行LGG溶液灌胃，200 μL/次，2次/周，連續(xù)灌胃5周。對(duì)照組和GVHD組給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 臨床特征觀察：移植后每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、毛色、飲食情況和排便情況等。每周稱量體質(zhì)量1次，記錄死亡情況。動(dòng)態(tài)觀察至術(shù)后8周。

1.2.3 肝臟功能和炎性因子的檢測(cè)：在術(shù)后第36天(即5周灌胃結(jié)束后)，每組各取4只小鼠,先麻醉,之后摘取眼球采血，用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransaminase,AST)、IL-6、IL-18和TNF-α的含量。

1.2.4 肝臟病理的檢測(cè)：將肝臟組織常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，于光鏡下觀察各組受鼠肝臟組織病理變化及炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)情況。肝臟病理評(píng)分參照以往標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2.5 PCR檢測(cè)小鼠腸道微生物群：先麻醉小鼠，處死后，解剖出小鼠大腸，擠出新鮮糞便，置于無菌離心管中凍存。按照糞便DNA提取試劑盒說明抽提各組小鼠的糞便總DNA，儲(chǔ)存于-20 ℃。以提取到的DNA為模板，對(duì)16S rDNA的V3及V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為：338正向:5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′; 806反向:5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′。擴(kuò)增結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，電泳后對(duì)條帶亮區(qū)切膠回收，用Quanti FluorTM-ST檢測(cè)定量，然后利用Illumina MiSeq測(cè)序儀測(cè)序。上機(jī)測(cè)定完成之后，進(jìn)行數(shù)據(jù)提取和合并。數(shù)據(jù)處理后比對(duì)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)，隨后進(jìn)行α多樣性分析和腸道微生物群門屬水平種類與豐度的多樣性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

*P<0.01 compared with the control group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with the GVHD group圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化曲線Fig 1 Curves of body weight change in mice of

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況及生存率

移植1周后，GVHD組小鼠呈現(xiàn)精神萎靡及進(jìn)食減少的表征；2周后呈現(xiàn)弓背及毛發(fā)干枯呈倒鉤狀，還有部分小鼠尾部皮膚脫落；3周后上述表現(xiàn)逐漸加重。LGG組小鼠在移植后3周前的狀態(tài)與GVHD組類似，而3周后上述癥狀明顯減輕。此外，移植后，GVHD組和LGG組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)明顯下降，其中GVHD組小鼠體質(zhì)量下降更為明顯(圖1)。LGG組小鼠體質(zhì)量在移植2周后下降趨勢(shì)趨于停止，且高于GVHD組(P<0.05)。GVHD組小鼠在移植后第14天開始出現(xiàn)死亡，死亡高峰期為移植后14～22 d；而LGG組小鼠僅在移植后第15天出現(xiàn)1例死亡，其生存時(shí)間長(zhǎng)于GVHD組(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小鼠移植后生存率比較Fig 2 Comparison of survival rates in mice of each group after transplantation

2.2 肝功能的檢測(cè)

移植后，GVHD組小鼠血漿ALT及AST/ALT值顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。相比GVHD組，LGG組血漿ALT(P<0.01)及AST/ALT值(P<0.05)顯著降低(圖3)。

*P<0.01 compared with the control group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with the GVHD group圖3 各組小鼠血漿ALT水平及AST/ALT值的比較Fig 3 Comparison of plasma ALT levels and AST/ALT values in mice of each n=4)

2.3 肝組織的病理

對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)正常(圖4A)。GVHD組小鼠肝組織出現(xiàn)大量肝細(xì)胞水腫、增生和壞死，以及大量炎性細(xì)胞如淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4C)。LGG組小鼠肝臟表現(xiàn)出一定程度的肝細(xì)胞水腫和壞死，然而其血竇纖維化明顯減輕，且浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞明顯減少(圖4B)。此外，GVHD組的肝病理學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而LGG組肝病理評(píng)分顯著低于GVHD組(P<0.01)(表1)。

表1 各組小鼠肝組織病理學(xué)評(píng)分

2.4 細(xì)胞因子

GVHD組血漿中IL-1β、IL-18及TNF-α的相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；與GVHD組相比，LGG組血漿中IL-1β、IL-18及TNF-α的相對(duì)含量顯著降低(P<0.01)(圖5)。

2.5 腸道微生物群相關(guān)檢測(cè)

2.5.1 α多樣性指數(shù):GVHD組shannon指數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；LGG組shannon指數(shù)明顯高于GVHD組(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠腸道微生物群α多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of intestinal microbiota in each group of n=4)

A.control; B.GVHD; C.LGG圖4 移植36 d后小鼠肝組織病理變化Fig 4 Pathological changes of liver tissue in mice 36 days after transplantation(×200)

2.5.2 腸道微生物群在門水平上的結(jié)構(gòu)組成:小鼠腸道微生物群在門水平上主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和變形菌門(Proteobacteria)組成。其中豐度相對(duì)較高的是擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門。移植后，小鼠腸道微生物群中擬桿菌門水平降低，放線菌門水平升高；經(jīng)LGG灌服后，擬桿菌門水平升高，放線菌門水平降低(表3)。

*P<0.01 compared with the control group; #P<0.01 compared with the GVHD group圖5 各組小鼠血漿IL-1β、IL-18和TNF-α水平Fig 5 Plasma levels of IL-1β, IL-18, and TNF-α in each group of n=4)

表3 各組小鼠腸道微生物群在門水平上的組成Table 3 Composition of intestinal microbiota at the phylum level in each group of n=4)

3 討論

GVHD是制約HSCT術(shù)后臨床療效的重要因素之一，其中累及肝臟的發(fā)生率為26.4%[8]。腸道微生物群是腸道微生物在腸道中形成的復(fù)雜群落。研究證實(shí)腸道微生物群會(huì)影響GVHD的發(fā)生與發(fā)展。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：HSCT后GVHD小鼠腸道中微生物群落多樣性降低，炎性細(xì)胞因子增多；且腸道微生物多樣化水平越低，GVHD越嚴(yán)重[9]。一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)顯示，HSCT后GVHD患者十二指腸的帕內(nèi)特細(xì)胞減少，且帕內(nèi)特細(xì)胞越少，治療效果越差[10]。在本研究中，GVHD組小鼠肝功能受損，肝組織呈現(xiàn)明顯炎性浸潤(rùn)，炎性因子水平升高，且腸道微生物群的多樣性下降，說明GVHD誘發(fā)的損傷減少了肝臟中腸道微生物群的多樣性。

益生菌是一類可以改善宿主微生態(tài)平衡的細(xì)菌，而益生元?jiǎng)t是腸道中為益生菌提供養(yǎng)料的物質(zhì)。益生菌和益生元在維持胃腸道穩(wěn)態(tài)方面起重要的調(diào)節(jié)作用[11]。研究表明，益生菌改善微生態(tài)平衡的作用機(jī)制包括抑制病原體、促進(jìn)免疫應(yīng)答、上調(diào)抗炎因子、重構(gòu)微生物群和保護(hù)腸道屏障等[12]。LGG是第三代益生菌，其黏著率高、定植力強(qiáng)。在干細(xì)胞移植前后口服LGG可提高生存率并降低急性GVHD的發(fā)生[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LGG灌服的小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)，腸道微生物群的多樣性升高，小鼠肝功能受損程度和炎性浸潤(rùn)程度減輕，說明LGG可能是通過改善腸道微生物群，介導(dǎo)抗炎作用進(jìn)而改善肝臟GVHD。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群，減輕肝臟炎性因子水平進(jìn)而緩解肝臟GVHD。相關(guān)調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步地探討和驗(yàn)證。