miR-141-3p通過靶向PDCD1抑制人胃癌細胞系AGS的遷移與侵襲

侯 楠，劉 源，高 俊，王 晶

(南陽市第二人民醫院 胃腸腫瘤科，河南 南陽 473000)

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第五常見的癌，且由胃癌造成的死亡成為僅次于肺癌，為第二常見的癌相關死因[1]。目前，盡管在GC的治療策略方面取得了明顯進展，但GC的預后仍不太理想[2]。GC的預后不良與GC的轉移密切相關，因此，研究影響GC轉移的關鍵分子靶點具有重要意義。

微RNA(microRNAs，miRNAs)是一類短的非編碼RNA，在眾多腫瘤的發生和進展中發揮重要作用。miR-141-3p是miR-200家族的成員之一，在前列腺癌、結直腸癌和膀胱癌等腫瘤組織中呈下調趨勢，且其發揮抑癌作用[3-5]。已有報道[6]表明，miR-141-3p能抑制GC細胞增殖，但其對胃癌細胞侵襲性的影響并不清楚。因此，本研究關注miR-141-3p對GC細胞遷移與侵襲的影響，并分析其中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與主要試劑:人胃黏膜細胞系(GES-1)和人胃癌細胞系(AGS)(中科院昆明細胞庫)；胎牛血清(FBS)(Life Technologies公司)；Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)(Gibco公司)；miR-141-3p的模擬物(miR-141-3p mimic)和miRNA的陰性對照(miR-NC)(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PDCD1)過表達的慢病毒載體(LV-PDCD1)和空載體(LV-vector)(上海漢恒生物技術有限公司)；Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司)；miRcute miRNA分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA RT-qPCR檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；熒光素酶報告基因載體、報告質粒和雙熒光素酶試劑盒(Promega公司)；PDCD1抗體(Abcam公司)；RIPA裂解液、HRP耦合的二抗和超敏ECL發光試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.1.2 組織樣本：收集南陽市第二人民醫院2018年7月至2019年12月收治并接受胃癌根治術的患者的腫瘤組織和對應的癌旁非腫瘤組織(距侵潤邊緣約2 cm組織，病理形態學正常的非腫瘤組織)，共計19例。本研究經南陽市第二人民醫院醫學倫理委員會批準(批準號：20180412013)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染：將GES-1和AGS細胞分別培養在含有10% FBS的DMEM中，并置于保持恒溫37 ℃和含5% CO2的細胞培養箱中。在細胞處于對數期時，收集細胞。

按照說明書步驟，用Lipofectamine 2000試劑分別將miR-141-3p mimic和miR-NC轉入AGS細胞。用RT-qPCR鑒定轉染效率后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-141-3p表達：用miRcute miRNA分離試劑盒分別提取樣本組織、GES-1和AGS細胞的miRNAs。然后用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對miRNA進行反轉錄。最后取反轉錄產物和各目的引物，用miRcute miRNA RT-qPCR檢測試劑盒在ABI 7500型RT-qPCR系統上進行RT-qPCR反應。反應條件為94 ℃預變性5 min，然后進行30個循環(94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min和72 ℃ 1 min)。本實驗所用的引物序列為：miR-141-3p正向序列： 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGACTCCAAC-3′，miR-141-3p反向序列： 5′-GGCGCATCTTCCAGTACAGT-3′；U6正向序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6反向序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應結束后，用U6作為內部對照，用2-ΔΔCt方法分析miR-141-3p的相對表達量。

1.2.3 Transwell小室法實驗檢測細胞的遷移與侵襲：分別將已轉染miR-141-3p mimic和miR-NC的AGS細胞的懸浮液(5×104個/mL，100 μL)添加到鋪有基質膠的濾膜(檢測細胞侵襲)或未鋪基質膠的濾膜(檢測細胞遷移)的Transwell板的上腔室中，然后將600 μL含10% FBS的DMEM添加到每個孔的下腔室中。孵育24 h后，將這些細胞用0.5%結晶紫溶液中染色30 min，并用濕棉簽除去上腔室中的細胞，隨后在顯微鏡下觀察并隨機取6個視野拍照。用Image J軟件對每個視野下的細胞進行計數。

1.2.4 熒光素酶報告基因驗證miR-141-3p與PDCD1是否具有靶向關系：Targetscan(http://www.targetscan. org/)顯示，miR-141-3p與PDCD1 mRNA的3′-UTR區存在潛在的結合位點。將包含PDCD1的3′UTR的DNA片段以及點突變DNA片段分別克隆到熒光素酶報道載體質粒中，然后分別將報告質粒和miR-141-3p minic或miR-NC共轉入AGS細胞。轉染48 h后，使用雙熒光素酶試劑盒測定螢光素酶含量。

1.2.5 Western blot檢測PDCD1的蛋白表達：用RIPA緩沖液裂解細胞并提取蛋白質。蛋白質經BCA試劑盒定量后，用等量蛋白質進行電泳。然后通過電轉法將電泳分離的蛋白轉移至PVDF膜上。封閉PVDF后，室溫孵育一抗(PDCD1，1∶2 000；GAPDH，1∶8 000)1.5 h，然后洗膜后，室溫孵育HRP耦合的二抗1 h。再次洗膜后，通過增強ECL發光試劑將目的印跡可視化并顯影至于膠片。用Image J軟件分析條帶的吸光度值，并以GAPDH為內部對照，計算目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 LV-PDCD1和LV-vector感染：取已轉染miR-141-3p mimic的AGS細胞，根據說明書步驟，將LV-PDCD1和LV-vector分別感染該細胞。簡言之，感染前1 d，將貼壁細胞以1×105個/孔鋪到24孔板中，次日，用含6 μg/mL聚凝胺的2 mL新鮮培養基替換原培養基，加入適量病毒懸液繼續培養48 h。并分別取轉染miR-141-3p mimic+LV-PDCD1、LV-PDCD1+LV-vector或miR-141-3p mimic的細胞，用Transwell小室法檢測細胞的轉移與侵襲。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-141-3p在GC組織和GC細胞中低表達

miR-141-3p在GC組織中的表達顯著低于癌旁非腫瘤組織(P<0.001)，其在AGS細胞中的表達也顯著低于GES-1細胞(P<0.001)(圖1)。

A.expression level of miR-141-3p in the non-tumor and tumor tissues (n=19); B.expression level of miR-141-3p in GES-1 cells and AGS cells (n=4); *P<0.001 compared with non-tumor tissues or GES-1 cells圖1 miR-141-3p在GC組織和細胞中低表達Fig 1 Lower expression of miR-141-3p in GC tissues and GC

2.2 過表達miR-141-3p抑制AGS細胞的遷移和侵襲

與miR-NC組比較，miR-141-3p mimic組細胞中miR-141-3p表達明顯升高(P<0.001)，遷移和侵襲明顯降低(P<0.001)(圖2)。

2.3 PDCD1是miR-141-3p的直接靶基因

PDCD1-3′UTR與miR-141-3p具有高度保守的結合位點；miR-141-3p mimic顯著降低了AGS細胞中野生型PDCD1的熒光素酶活性(P<0.01)，但突變體PDCD1未觀察到該結果。與miR-NC組比較，miR-141-3p mimic組細胞中PDCD1的蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)(圖3)。

2.4 miR-141-3p通過靶向PDCD1來抑制AGS細胞的遷移和侵襲

與miR-141-3p mimic+LV-vector組比較，miR-141-3p mimic+LV-PDCD1組AGS細胞的遷移和侵襲能力明顯增強(P<0.01)(圖4)。

3 討論

GC細胞的遷移與侵襲能力不僅能直接影響GC患者的轉移還能影響GC的預后。近來研究發現，有眾多miRNAs能參與調控GC細胞的遷移與侵襲[7-8]。然而，miRNAs的數量眾多，依然有許多參與調控GC細胞的遷移與侵襲的miRNAs未能發現或充分鑒定，且已發現的參與調控GC細胞的遷移與侵襲的miRNAs可能在維持機體正常生理活動中發揮重大作用[7-8]； 因此， 仍需進一步對能影響GC細胞的遷移與侵襲的miRNAs進行篩選和鑒定。本研究發現，miR-141-3p在GC組織和GC細胞中低表達，而過表達miR-141-3p能抑制AGS細胞遷移與侵襲，提示，過表達miR-141-3p可能是潛在的抗GC轉移的策略。

A.after transfected of miR-141-3p mimic or miR-NC into AGS cells, the expression level of miR-141-3p were detected; B.representative images of cell migration and invasion(×200); C.cell migration and invasion count; *P<0.01,**P<0.001 compared with the miR-NC group

A.binding site of miR-141-3p and PDCD1 predicted by bioinformatics software; B.results of dual luciferase reporter gene analysis of miR-141-3p and PDCD1; C.after over-expression of miR-141-3p, the protein expression level of PDCD1 in AGS cells; *P<0.01 compared with the miR-NC group

A.representative images of cell migration and migratory cell count; B.representative images of cell invasion and invasive cell count; *P<0.01, **P<0.001 compared with the miR-NC+LV-vector group; #P<0.01 compared with the miR-141-3p mimic+LV-vector group

miRNA一般是通過與靶基因的3′-UTR區通過堿基配對模式結合，并在轉錄后水平發揮生物學效應。本研究采用靶基因預測軟件發現，miR-141-3p與PDCD1 mRNA的3′-UTR區存在潛在的結合位點。PDCD1是一種免疫球蛋白，主要在活化的CD4+/CD8+T細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(natural killer，NK)細胞和髓樣細胞的表面上表達[9]。迄今越來越多的證據[10-11]表明，PDCD1在腫瘤細胞也廣泛表達，且其可有助于腫瘤細胞逃避免疫監視，從而提高了腫瘤細胞的遷移與侵襲能力。miR-141-3p是miR-200家族成員，而miR-200家族是PDCD1潛在調節劑。許多研究[12-13]表明了miR-200家族成員和PDCD1在腫瘤和免疫細胞上的表達水平之間的相關性。因此，需進一步研究miR-141-3p與PDCD1之間的潛在關系，本研究通過熒光素酶法表明PDCD1是miR-141-3p的靶基因，且過表達miR-141-3p能抑制PDCD1表達。已有研究[14]表明，抑制PDCD1能抑制GC細胞的增殖和轉移能力。這些結果提示，過表達miR-141-3p對AGS細胞的遷移與侵襲的抑制作用可能是通過抑制靶基因PDCD1的表達來實現的。為證明這一推測，本研究進一步通過轉染LV-PDCD1觀察其對已過表達miR-141-3p的AGS細胞遷移與侵襲的影響，發現LV-PDCD1能幾乎逆轉過表達miR-141-3p對AGS細胞遷移與侵襲的抑制作用，這一結果充分說明了，miR-141-3p是通過下調靶基因PDCD1來抑制AGS細胞的遷移與侵襲。

綜上所述，本研究表明上調miR-141-3p可通過抑制PDCD1表達來抑制GC細胞遷移和侵襲，這些發現可能為GC的治療提供新的思路。