益生菌改善高脂高糖飼養誘導的肥胖小鼠脂代謝紊亂

黃 婷，李真真，白 楊，劉惠雙

(鄭州市第七人民醫院 1.內分泌科； 2.營養科，河南 鄭州 450016)

隨著社會經濟的發展，人們生活習慣和飲食結構的改變，全世界范圍內，尤其是兒童青少年人群中肥胖發生率逐年上升[1]。肥胖(obesity)是由多種因素相互作用導致能量和代謝紊亂，為引起糖尿病、冠心病等多種疾病的重要危險因素，已成為威脅人類健康的公共衛生問題[2]。腸道微生物群是人體最大的微生態系統，與肥胖、遺傳、胰島功能障礙等密切相關，其中嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌是常見的腸道益生菌(probiotics)，可通過調節腸道微生物群緩解高脂高糖飲食引起的肥胖，是近年來治療因肥胖引起的脂代謝紊亂的潛在方案[3]。而AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)介導的自噬途徑參與肥胖引起的脂代謝紊亂，激活該通路可通過促進自噬，減輕肝臟脂肪積累[4]，Ⅲ型纖連蛋白結構域5可通過上調AMPK/mTOR介導的小鼠肝細胞自噬和脂肪酸氧化，減少脂肪生成，減輕肝高脂血癥[5]。但益生菌是否通過調控AMPK/mTOR通路介導的自噬改善肥胖小鼠脂代謝紊亂，目前尚未有研究。本研究通過構建高脂高糖誘導的肥胖小鼠模型，并使用益生菌和AMPK抑制劑Dorsomorphin進行干預，旨在從AMPK/mTOR通路揭示益生菌對肥胖小鼠脂代謝紊亂的改善作用，為益生菌對肥胖引起脂代謝紊亂的治療提供理論參考。

the black arrow indicated autophagosome圖1 各組小鼠肝臟組織病理學、脂肪蓄積及自噬小體比較Fig 1 Liver histopathology, fat accumulation and autophagy bodies of mice in each group

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級C57BL/6J小鼠(50只，3～4周齡，雄性，體質量13～15 g)[大連醫科大學，許可證號：SCXK(遼)2018-0003]。按照3R原則給予實驗動物人道的關懷照顧。

1.1.2 益生菌及藥物：本研究所用益生菌種(嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌)(大連醫科大學微生物教研室)；Dorsomorphin(又名compound C，是一種選擇性，ATP競爭性AMPK抑制劑)(MedChemExpres公司)。

1.1.3 主要試劑：普通飼料和高脂高糖飼料(北京博泰宏達生物技術有限公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和β-actin鼠抗(Sigma-Aldrich公司)；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)；4%多聚甲醛和2.5%戊二醛溶液(武漢塞維爾生物科技有限公司)；油紅O染液(北京索萊寶生物科技有限公司)；醋酸鈾、枸櫞酸鉛、蘇木精、伊紅染液(上海生工生物科技有限公司)；SREBP-1c、LC3、Beclin1、AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR鼠抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：小鼠適應性飼養1周后，將小鼠隨機分為對照組，模型組、益生菌組(益生菌培養至對數期后，進行菌落計數，每種菌各以2×109CFU的菌液進行灌胃)、抑制劑組(AMPK抑制劑Dorsomorphin[6]，靜脈注射1次，劑量為10 mg/kg)、益生菌+抑制劑組(每種菌各以2×109CFU的菌液進行灌胃前30 min，靜脈注射Dorsomorphin 1次，劑量為10 mg/kg)，每組10只，對照組和模型組分別注射和灌胃等量溶劑。其中對照組小鼠以普通飼料飼喂，其余各組小鼠以高脂高糖飼料飼喂。所有小鼠均自由攝食飲水，飼養環境相對濕度50%～60%，明暗周期12 h，溫度23 ℃～25 ℃，連續飼養6周，每隔1周記錄小鼠體質量。

1.2.2 全自動生化分析儀檢測血清血脂：取尾靜脈血，2 000 r/min，離心10 min后取血清，采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglyceride，TAG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的含量。并分離肝臟組織，等分成4份，分別置于4%多聚甲醛、OCT包埋劑、2.5%戊二醛及-80 ℃冰箱中待用。

1.2.3 HE染色觀察各組小鼠肝臟組織病理學變化：取上述1.2.2中使用4%的多聚甲醛固定24 h的肝組織，行常規蘇木精-伊紅染色后，置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 油紅O染色觀察各組小鼠肝臟組織中脂肪蓄積情況：取上述1.2.2中使用OCT包埋劑包埋的肝組織進行切片，行常規油紅O染色后，將切片置于光學顯微鏡下，觀察脂滴并拍照，脂滴呈橘紅色至鮮紅色。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠肝臟組織中自噬小體：取上述置于2.5%戊二醛中固定2～4 h后的肝組織，使用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，制作常規超薄切片(60～80 mm)，用2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色15 min，室溫干燥過夜，透視電子顯微鏡觀察肝臟組織自噬小體。

1.2.6 Western blot檢測各組小鼠肝臟組織中LC3、Beclin、SREBP-1c、AMPK、mTOR蛋白表達：使用蛋白提取試劑盒提取-80 ℃冰箱中的各組肝臟組織總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉、1∶2 000濃度稀釋后的LC3、Beclin、SREBP-1c、AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR、β-actin鼠抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，β-actin為內參，全能型凝膠成像分析系統分析蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠體質量變化比較

與對照組相比，模型組小鼠體質量均升高(P<0.05)；與模型組相比，益生菌組小鼠體質量均降低(P<0.05)，抑制劑組小鼠體質量均升高(P<0.05)；與益生菌組相比，益生菌+抑制劑組小鼠體質量均升高(P<0.05)；與抑制劑組相比，益生菌+抑制劑組小鼠體質量均降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠體質量變化比較

2.2 各組小鼠血脂水平比較

與對照組相比，模型組小鼠TC、TAG和LDL升高，HDL降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌組小鼠TC、TAG和LDL降低，HDL升高(P<0.05)；抑制劑組小鼠TC、TAG和LDL升高，HDL降低(P<0.05)。與益生菌組相比，益生菌+抑制劑組小鼠TC、TAG和LDL升高，HDL降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，益生菌+抑制劑組小鼠TC、TAG和LDL降低，HDL升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠血脂水平比較Table 2 Comparison of blood lipid levels of mice in each mmol/L, n=10)

2.3 各組小鼠肝臟組織病理變化、脂肪蓄積及自噬小體比較

對照組小鼠肝臟組織著色均勻，無明顯脂肪空泡，無脂肪蓄積。與對照組相比，模型組小鼠肝臟組織出現明顯的空泡，細胞核染色加深，出現大量脂肪蓄積，自噬小體數目減少。與模型組相比，益生菌組小鼠肝臟組織著色趨于均勻，脂肪空泡減少，脂肪蓄積不明顯，自噬小體數目增多；抑制劑組小鼠肝臟組織脂肪空泡增多且變大，出現嚴重脂肪蓄積，自噬小體數目減少。益生菌+抑制劑組較益生菌組脂肪空泡增多和蓄積現象加重，較抑制劑組減輕，自噬小體數目較益生菌組減少，較抑制劑組增多(圖1)。

2.4 各組小鼠肝臟組織中脂代謝相關蛋白SREBP-1c、自噬相關蛋白LC3、Beclin1蛋白表達水平及AMPK和mTOR蛋白磷酸化水平比較

與對照組相比，模型組小鼠SREBP-1蛋白表達及mTOR磷酸化水平升高，LC3和Beclin1蛋白表達及AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌組小鼠SREBP-1c蛋白表達及mTOR磷酸化水平降低，LC3和Beclin1蛋白表達及AMPK磷酸化水平升高(P<0.05)； 抑制劑組小鼠SREBP-1c蛋白表達及mTOR磷酸化水平升高，LC3和Beclin1蛋白表達及AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)。與益生菌組相比，益生菌+抑制劑組小鼠SREBP-1c蛋白表達及mTOR磷酸化水平升高，LC3和Beclin1蛋白表達及AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，益生菌+抑制劑組小鼠SREBP-1c蛋白表達及mTOR磷酸化水平降低，LC3和Beclin1蛋白表達及AMPK磷酸化水平升高(P<0.05)(圖2)。

3 討論

肥胖是當今人類最普遍的健康問題之一。本研究通過構建小鼠肥胖模型，發現模型組肥胖小鼠發生脂代謝紊亂且肝臟組織自噬減弱。腸道微生物群與肥胖兩者可通過遺傳、代謝等機制相互作用。其中乳酸菌和雙歧桿菌能夠誘導骨髓充質干細胞的自噬激活，參與益生菌保護作用[7]。有實驗證明益生菌對高脂肪飲食引起的小鼠代謝紊亂的保護作用[8]，但脂代謝相關蛋白SREBP-1c表達的升高可加重肝脂質積累[9]。本研究通過使用益生菌干預肥胖小鼠，發現益生菌可改善肥胖小鼠脂代謝紊亂，提高肝臟細胞自噬，但其中的機制并未完全闡明。

噬在脂質代謝中發揮重要作用，山茶酚可能通過AMPK/mTOR介導的自噬，使肝組織脂質存儲減少、自噬小體增加[10]。酰基轉移酶可通過AMPK/mTOR途徑誘導自噬，從而減輕脂肪毒性[11]。醋氨酚可通過抑制AMPK通路，激活mTOR途徑， 從而抑制自噬，加重非酒精性脂肪性肝病中脂肪堆積[12]；紅蓮孢菌素龍膽二糖苷可通過激活AMPK信號通路，降低肥胖小鼠體質量，抑制脂質積累[13]。激活AMPK可通過負調控mTOR通路促進自噬，減輕脂肪毒性。成纖維細胞生長因子21(FGF21)通過抑制AMPK/mTOR信號通路刺激胰島細胞自噬[14]，這與上述研究并不一致。但是，關于自噬與細胞及疾病關系一直是爭論的焦點，細胞既可通過提高自噬減少細胞壞死，減輕有毒物質的積累，又可通過主動降低自身自噬活性，減少因自噬引起的細胞死亡[15]。本研究發現益生菌可能通過激活AMPK通路，負調控mTOR，促進肝細臟自噬，改善肥胖小鼠脂代謝紊亂。進一步探討發現益生菌對肥胖小鼠肝細臟自噬的促進作用及對脂代謝的改善作用可被AMPK抑制劑Dorsomorphin逆轉，進一步揭示益生菌可能通過AMPK/mTOR通路提高自噬，改善肥胖小鼠脂代謝紊亂。

1.control group; 2.model group; 3.probiotics group; 4.inhibitor group; 5.probiotics+inhibitor group;*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the model group; △P<0.05 compared with the probiotics group; ▲P<0.05 compared with the inhibitor group

綜上所述，益生菌可能通過激活肥胖小鼠肝臟組織中AMPK，進而負調控mTOR通路，促進自噬，減輕肝臟脂質積累，改善脂代謝紊亂。但是益生菌對肥胖小鼠脂代謝紊亂的作用機制較復雜，尚需后續深入研究。