一種食用菌細菌性病害防治粉劑的研究

劉沛然 劉天宇 鄔雅君 倪萌 袁淼

摘要：我國目前暫時沒有一種專用的殺菌劑是用于食用菌細菌性病害的，但是食用菌產業病害防治依然嚴峻，因此開發一種專用于食用菌細菌病害的安全、穩定藥劑是非常具有現實意義的。本論文提供了一種復方殺菌粉劑，通過與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的對比試驗驗證得到粉劑具有明顯且更優的殺菌抑菌的效果的結論，且通過緩釋試驗及穩定性試驗的測試驗證了該粉劑具有較強的穩定性和保質期，并具備一定的市場應用潛力。

關鍵詞：二氧化氯;粉劑;性能;評價

前言：

食用菌由于不適應條件，或是其他有害生物的侵染引起的發育緩慢、畸形、枯萎甚至死亡等異常現象，會降低食用菌產量和品質，此統稱為食用菌病害[1]。

然而，我國對食用菌細菌性病害的研究基礎薄弱，沒有一種專用的殺菌劑是用于細菌性病害的，多是由醫療衛生、食品加工等領域應用的殺菌劑引申移植過來的，針對性不強，防治效果不佳。開發一種專用于食用菌細菌病害的安全、穩定殺菌劑是非常具有現實意義的。

1食用菌細菌性病害的防治

截至目前防治細菌性病害最有效的方法仍然是化學防治，被國家認證的用于食用菌病害防治的藥劑僅有10種[2]。

而目前國內對食用菌子實體細菌性病害的防治常用藥物有四類：第一類為多菌靈或托布津藥液;第二類為克霉靈、萬消靈;第三類是四環素和農用鏈霉素;第四類是二氧化氯[3]。

而本文涉及到的一種食用菌細菌性病害防治粉劑即使用二氧化氯作為主要的殺菌有效成分并以殼寡糖作為輔助殺菌劑。其具備良好的抑菌殺菌效果。

2粉劑制備及致病菌的提取

2.1粉劑的調配

在制備時首先采用微膠囊化技術[5]，有效實現反應組分主體材料的隔離及鈍化;將處理后的活性原料組分與無水氯化鈣混合制成中間體A。

其次用硫酸鎂與液體的殺菌增效劑烷基糖苷制成中間體B[5]。再將A和B按比例混合后進行直接分裝成粉劑。

綜上可得食用菌殺菌粉劑配方組成如表1。

2.2病原菌分離純化的實驗準備

2.2.1實驗儀器與材質

（1）本實驗過程中所用主要儀器如下：

SW-CJ-1FD型潔凈工作臺

DHP-9272型恒溫培養箱

DK-98-11型電熱恒溫水浴鍋

YX-280A型壓力蒸汽滅菌鍋

DMS600型數碼液晶生物顯微鏡

（2）供試褐斑病菌株從河北省靈壽縣小韓樓村食用菌種植基地采集袋栽金針菇發菌之后感染褐斑病的金針菇菌袋，經分離純化得到供試病原菌株。

供試藥劑：自制二氧化氯溶液。實驗室自制營養肉湯培養基與瓊脂平面培養基[5]。

2.2.2 分離和確定試驗以及其結果討論

2.2.2.1 病原菌的分離純化和確定

在無菌的超凈工作臺中，采用平板劃線法采集金針菇菌蓋上的病原菌菌種，得原始混合菌[5]。

將其培養并挑取單菌落培養并分離純化至無異樣菌落出現[5]，所得純菌株可保存至斜面培養基備用。

將分離純化得到的幾個細菌菌株分別置于液體培養基中，用噴霧器分別噴灑并觀察金針菇是否發生褐斑病。

使用單染色法進一步確定病原菌菌株類型[5]。

2.2.2.2分離純化及確定的結果

經多次分離純化后，得到了兩種不同的菌株：A菌和B菌。

試驗顯示，噴灑A菌菌懸液和原癥狀完全相同。而接種B菌懸液沒有發生病變，可初步斷定A菌為致病菌。

再將兩種病原菌進行單染色處理，通過顯微鏡觀察發現：A菌為短桿狀，B菌為球狀。由文獻查得[7]，金針菇褐斑病病原菌為一種假單胞桿菌，由此可以判斷A菌為褐斑病病原菌，這與上述回接感染的結論是一致的。

3防治粉劑的性能研究

3.1抑菌性實驗

3.1.1材料與方法

3.1.1.1材料與主要設備及儀器

（1）原料：實驗室自制殺菌粉劑。

（2）菌種：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌：中科院微生物研究所;實驗室分離純化所得病原菌菌種。

（3）主要設備：

LRH-250 型生化培養箱，

DHG- 9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，

SW-CJ-1FD 型單人單面凈化工作臺，

DSX-280AI 型不銹鋼手提式滅菌鍋，

JJ-型精密電子天平。

3.1.1.2 試驗方法

通過以殺菌粉劑對三種致病菌的抑制作用的結果進行對照分析研究，可直觀得到殺菌粉劑對于致病菌菌種專一殺菌的優勢效果。

（1）試驗準備

菌懸液的制備：將大腸桿菌、金色葡萄球菌以及病原菌菌種制成1.5×108MPN/mL的菌懸液[5]。并制備兩套相同的菌懸液，分別命名為A試驗組和B試驗組。

將實驗室按配比自制的殺菌粉劑溶于無菌水中，并按照序列制備各組溶液。

（2）接種菌種

使用A試驗組菌懸液，將三種菌種以無菌操作稀釋一定倍數，分別取0.1mL涂布于三個相等的固體培養基，放入第一組若干相等的牛津杯，培養后測量抑菌環大小[6]。

以此組作為后續試驗的空白對照組。

另準備一組牛津杯，按照上述步驟操作，將稀釋好的三種菌種的稀釋液放入濃度為2g/L的牛津杯中，置于培養后測量抑菌環大小。

將上述操作重復6次，完成后續序列中的殺菌粉劑試驗組的菌種的接種。

使用B試驗組的菌懸液，按照A試驗組試驗辦法，完全重復一次試驗操作。

（3）試驗數據處理

采用spss13.軟件的LSD多重比較模塊進行差異顯著性檢驗[9]。將兩組實驗數據進行對比分析，觀察是否達到預期效果，并總結試驗結論。

3.1.1.3結果與討論

粉劑對病原菌菌種的抑制作用結果：測量A、B兩試驗組測量每組中每一單元的抑菌環大小。

A、B兩試驗組的結果分別如表2、3所示。

由表3和表4可以看出，殺菌粉劑對病原菌菌種有明顯的抑制作用，并且相較于大腸桿菌和金黃色葡萄菌擁有更加出色的抑菌效果，且隨著抑菌粉劑用料的升高，抑菌能力逐漸增強。另外從表中可以分析出，粉劑對革蘭氏陰性菌的抑制程度高于陽性菌，其證明粉劑抑菌性對致病菌同樣有優越效果。

3.2殺菌劑穩定性及緩釋性測定

3.2.1穩定性

實驗釆用熱加速試驗法測定自制殺菌粉劑的穩定性能[5]，放置前后分別測定二氧化氯的有效含量，計算有效成分下降率。

每次進行三組實驗，且加速穩定性試驗的結果評價以有效成分下降率不超過10%為合格[8]。

使用此方法檢測粉劑，14天后測得其有效成分含量下降了7.53%，低于10%，則該二氧化氯固體殺菌劑可以儲存一年。

3.2.2緩釋性

將自制的食用菌細菌性病害防治粉劑配置成二氧化氯理論濃度為500mg/L的溶液，放置在室溫條件下，在不同時間測試其中有效成分二氧化氯的含量，自制殺菌劑有效成分二氧化氯的濃度在24h內達到最大值。緩釋型藥劑可以長時間持續殺菌。

4結論

本研究主要對感染了褐斑病的金針菇做了研究，對其致病菌進行了分離純化，確定病原菌是一種革蘭氏陰性菌。且經穩定性試驗驗證，該配方穩定性良好，符合《消毒技術規范》對消毒劑產品的要求。以分離得到的菌株作為本研究的作用對象，并用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為對照，進行了抑菌環實驗證明該自制的食用菌細菌性病害防治粉劑對金針菇褐斑病病原菌具有良好的殺滅效果，達到了試驗預期的結果，是一款具有安全和穩定性質的良好殺菌劑型。

筆者認為此項發明還有待發掘的技術潛力，日后還有待進行更深入的研究，以期達到對食用菌細菌性病害的有效率達到100%，并使得食用菌產品的增產幅度達30%以上的戰略目標。

參考文獻：

[1] MIN H K， SEONG W P. Bacteria Phases of Pseudomonas Tolaasi for the Biological Control of Brown Blotch Disease. Korean Biochemistry， 2011， 54（）： 99-104.

[2] 劉萌松，劉勝海.食用菌病蟲害綜合防治.農民致富之友，2012， 20： 50.

[3] 蔡為明，金群力，馮偉林，等.金針菇細菌性斑點病的安全高效防治技術.浙江食用菌， 2007.

[4] GRANSTROM M L， LEE G F. Generation and Use of Chlorine Dioxide in Water Treatment. Joumal （American Water Works Association）， 1958： 1453-1466.

[5] 牛佳靜. 食用菌細菌性病害防治藥劑的開發[D].河北科技大學，2014.

[6] 馮小強，等.不同分子量殼聚糖對大腸桿菌抑制作用規律及其機理探討[J].中國釀造，2007，（2）：16-19.

[7] KOJ L， HSUCI， LIN R H， et al. A New Fungal Immunomodulatory Protein， FIP - fve Isolated from the Edible Mushroom， Flammulina Velutipes and Its Complete Amino Acid Sequence. European Journal of Biochemistry， 1995， 228（2）： 244-249.

[8] 中華人民共和國衛生部. 消毒技術規范.北京：中華人民共和國衛生部， 2002： 124-126.

[9] 張筠，付紅巖，穆曉麗. 殼寡糖對兩株致病菌抑制作用的研究 [J] . 食品科技，2009 （2）：225-227.

河北科技大學化學與制藥工程學院 河北 石家莊 050000