生物炭對土壤細菌種群多樣性的影響

侯寧，宋秋穎，王啟全，張楠楠

（東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

Cr是一種有毒重金屬物質，近年來現代工業高速發展，環境中Cr含量逐漸升高，嚴重破壞生態環境，危害人體健康。生物炭（Biochar，BC）是在限氧條件下通過生物質熱解獲得的材料，因其具有良好介孔結構及豐富的表面官能團，已被應用于各類型環境污染物吸附研究[1]。目前，Yang等發現生物炭在降解污染物方面存在潛在應用[2]，被大量用作光催化反應催化劑或催化劑載體應用于污染物降解以及環境修復中[3]。萬文亞研究表明，加入生物炭可抑制光生空穴-電子對復合，且拓寬光吸收范圍，提高光催化性能，從而提高污染物降解效率[4]。

值得注意的是，Purakayastha等研究表明生物炭在處理重金屬方面效果突出[5]，而生物炭在處理重金屬過程中對環境尤其是環境微生物造成的影響目前鮮為人知，這一問題影響未來生物炭推廣和使用。

本研究在生物炭對重金屬處理方面具有突出效果基礎上，探究不同來源生物炭施加對環境微生物的影響：①大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭表征分析；②大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭對Cr（Ⅵ）污染土壤中黑麥草生長影響分析；③大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭對土壤細菌多樣性影響。研究旨在為秸稈合理利用策略提供理論依據，為生物炭光催化降解污染物修復環境污染提供科學依據，對生物炭應用推廣具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭材料制備

大豆秸稈取自黑龍江省哈爾濱市東北農業大學農學院實驗實習基地。脫水污泥取自哈爾濱市文昌污水處理廠。大豆秸稈及脫水污泥經清洗后烘干，粉碎，在80℃烘箱內烘干過夜。使用管式爐500℃溫度下制備大豆秸稈生物炭（D500）及脫水污泥生物炭（S500）。炭化后樣品經研磨過篩（100目）后備用。

1.1.2 土壤來源

土壤樣品來自于黑龍江省哈爾濱市東北農業大學向陽試驗示范基地常年耕作土壤。供試土壤pH、有機質和陽離子交換量（CEC）分別為7.12、10.22和16.14 cmol·kg-1，土壤中總N、總P、總K含量分別為1.1、0.96、20.8 g·kg-1。

1.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭材料表征

使用傅里葉紅外變換光譜，可對大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭含有基團定性分析。

利用掃描電鏡分析分析大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭表面構型。

本文使用XRD分析大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭，XRD主要參數為：40 kV，40 mA，2θ角掃描范圍10°~60°，掃描速度2°·min-1。

1.3 盆栽試驗

使用黑麥草作為本試驗指示性植物。利用盆栽試驗開展大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭對Cr（Ⅵ）污染土壤修復研究。

試驗具體方法如下：剔除土壤中植物根莖，粉碎土壤，在通風處風干后過2 mm篩，每盆裝入2 kg試驗土待用。將0.1 mg·mL-1Cr（Ⅵ）溶液1 000 mL拌入土壤中，分為4個試驗組：試驗組1（同時加入大豆秸稈生物炭D500 100 g）、試驗組2（同時加入脫水污泥生物炭S500 100 g）、試驗組3（Cr（Ⅵ）污染土壤），試驗組4（空白對照組CK），充分混勻，保證供試土壤完全浸濕。靜置24 h穩定土壤環境。

試驗期間，土壤含水量始終保持在60%，測定玻璃溫室內日間溫度為29℃，夜間溫度為22℃。每經過2 d相互交換盆栽在溫室中位置，保證盆栽培養條件相同。在玻璃溫室中開展為期30 d盆栽試驗。

1.3.1 植物生長、生理指標測定

使用直接收獲法，盆栽試驗第30天時，取出植物用水清理后去除表面水分，使用直尺測量黑麥草株高和根長，將植物放入烘箱烘干后使用電子天平稱量確定植物生物量。

1.3.2 土壤中細菌多樣性檢測

盆栽30 d后收集各試驗組土壤，并將試驗組1、2、3和4土壤樣本送至上海生工生物工程有限公司作高通量16S rRNA測序，檢查土壤樣本中細菌群落相對豐度和樣本多樣性。

1.4 統計分析

所有試驗重復3次。圖片和表格中數值表示平均值。使用Origin 2020分析平均值和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭表征

2.1.1 傅里葉紅外光譜分析

傅立葉紅外光譜結果如圖1所示，圖1a為500℃溫度下制備大豆秸稈生物炭（D500）紅外光譜圖，分析發現生物炭上具有-OH（3 000 cm-1）、芳香基團（1 400 cm-1）、羧基（-COOH1 600 cm-1）等含氧官能團。其中芳香苯環（C=C）所代表芳香族結構可提高生物炭電子傳遞能力，使生物炭作為氧化還原介質，促進環境中非定域化氧化還原反應發生[6]。與此同時，大豆秸稈生物炭因羧基基團（-COOH）使大豆秸稈生物炭具備一定光敏性，羧基基團（-COOH）與其他含氧官能團（即-OH，OC-O和C-O）共同在生物炭光催化產生自由基氧化物質（ROS）過程中發揮重要作用[7]。圖1c為脫水污泥生物炭（S500）紅外光譜圖，可發現脫水污泥生物炭官能團與大豆秸稈生物炭官能團十分相似。

將脫水污泥生物炭（S500）主要官能團含量（見圖1b）與大豆秸稈生物炭（D500）中主要官能團含量（見圖1d）作對比，發現S500中官能團主要為1 400 cm-1處羧基（-COOH）基團以及500 cm-1附近=C-H基團，大豆秸稈生物炭（D500）中-OH基團（3 000 cm-1）與C-H基團（3 500 cm-1）相較于脫水污泥生物炭（S500）有所增加。

圖1 生物炭FTIR光譜Fig.1 FTIR spectrum of biochar

2.1.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭掃描電鏡分析

圖2是大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭掃描電鏡表征結果。由圖2a可見，脫水污泥生物炭（S500）多級孔隙結構明顯，孔形狀規則，表面積大，這種特點賦予生物炭良好吸附性能。通過圖2b可發現，大豆秸稈生物炭（D500）縱面結構存在孔隙，且孔隙均勻，呈橢圓形，孔徑內壁光滑，孔內仍有組織斷續連接。綜上，生物炭孔隙結構豐富，可作為一種富孔碳材料，為去除污染物提供充足吸附位點。

圖2 生物炭掃描電鏡結果Fig.2 Scanning electron micrograph of biochar

2.1.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭XRD分析

圖3為脫水污泥生物炭（S500）和大豆秸稈生物炭（D500）X衍射光譜圖，熱解碳化后兩種生物炭XRD曲線中均發現兩個明顯的包峰，為非晶XRD線形。XRD曲線中存在微弱石墨相碳衍射峰，代表生物質原料在熱解過程中發生石墨化，且生物炭中還存在大量非石墨化雜碳所致。石墨烯以及氮化碳（C3N4）共軛聚合物等石墨碳化物均具有優良光催化性能，說明石墨化結構有利于增強生物炭光催化活性。生物炭中形成的石墨相碳結構，通過建立π共軛能帶的sp2雜化碳結構，降低帶隙能量，提高導電性，促進光催化過程中載流子擴散與轉移，提高光催化活性。

圖3 生物炭XRD光譜Fig.3 XRD spectrum of biochar

2.2 大豆秸稈生物炭和脫水污泥生物炭對Cr（Ⅵ）污染土壤黑麥草生長的影響

經30 d盆栽試驗，結果如圖4所示。黑麥草在CK、Cr（Ⅵ）污染以及脫水污泥生物炭（S500）和大豆秸稈生物炭（D500）修正后，30 d不同組黑麥草生長趨勢大體相似，但不同組間株高、根長和生物量卻差異顯著（P<0.05），其中，大豆秸稈生物炭（D500）修復效果最佳，經兩種生物炭修復過土壤中生長的黑麥草長勢均優于受Cr（Ⅵ）污染土壤中生長的黑麥草。值得注意的是，經大豆秸稈生物炭（D500）修復過土壤中生長黑麥草長勢較未污染土壤中生長黑麥草旺盛。綜上，生物炭具有良好Cr（Ⅵ）修復效果和土壤改良效果，在污染修復同時促進植物生長。

圖4 Cr(Ⅵ)脅迫對黑麥草生長指標的影響Fig.4 Effect of Cr(Ⅵ)stress on growth index of ryegrass

2.3 土壤的細菌群落結構及種群多樣性分析

從豐度稀釋曲線（圖5a）中可看出，當序列數量大于10 000時OTU種數量進入一個增長緩慢趨于平緩階段。從Shannon指數稀釋曲線（圖5b）中可看出，當序列數量到達2 000時，Shannon指數曲線已達到平臺期，即表明曲線趨近于平緩，說明隨測序深度增加，出現的細菌新屬開始減少，同時新檢測到細菌屬己不再是該生境中優勢細菌。

圖5 豐度及Shannon指數稀釋曲線Fig.5 Richness and Shannon rarefaction plot

如圖6所示，4個樣品共產生11 010個OTU，試驗組1~4土樣所包含OTU數目分別為3 255、2 970、2 324和2 641。僅有950個OTU同時出現在4組土樣中，由此可推論脫水污泥生物炭（S500）和大豆秸稈生物炭（D500）投加改變污染土壤細菌種群結構，提高Cr（Ⅵ）污染與空白（CK）細菌種群結構相似性。

圖6 不同處理土壤細菌OTU分布Fig.6 Distribution of soil bacteria OTU in different treatments

本研究確定在Cr（Ⅵ）污染條件下，土壤中不同來源生物炭對Cr（Ⅵ）污染修復后引起土壤細菌種群結構組成變化。通過高通量測序技術對土壤樣品16S rRNA作基因測序。第30天時采集土壤樣品，各樣本數據信息統計見表1。共獲得178 433個高質量細菌V3~V4 Illumina序列，每個讀數范圍為58 655至62 117個序列，用于進一步分析。97%序列相似度水平下，可發現在質量控制之后剩余reads數目中試驗組1>試驗組2>試驗組4>試驗組3。物種豐度通過Chao1指數與ACE指數高低體現，試驗組1物種豐度高于試驗組2，且二者均高于試驗組3與4。

表1 各樣本數據信息統計Table 1 Statistics of each sample data

各樣本中土壤細菌多樣性由Shannon指數估算，試驗組1多樣性高于試驗組2，且二者均高于試驗組3與4。比較4組樣本Shannon指數可知，4個土壤樣本中細菌群落多樣性排序為：試驗組1>試驗組2>試驗組4>試驗組3。研究發現生物炭本身含有大量有機物質，具有比表面積大和多孔隙結構等特性，其特性改善土壤結構，調節土壤pH，為微生物提供適宜生存環境，提高細菌種群多樣性。

2.4 大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭對土壤細菌門影響分析

基于OTU物種分類結果，在門分類級別上分析各樣本中細菌種類和相對豐度。如圖7a所示，添加大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭后對樣品中細菌豐度影響較大。土壤樣品中細菌在門水平上分類大致相同，但比例略有不同。4個樣品中，變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroide?tes）以及酸桿菌門（Acidobacteria）占比超過土壤門豐度75.01%，與丁自立研究發現重金屬污染土壤對不同重金屬污染修復的細菌菌落主要分為三大類（變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門）結果一致[8]；其中變形桿菌門（Proteobacteria）在試驗組3中占比為62.06%；試驗組4中占比為55.19%；在試驗組1中占比為47.10%；在試驗組2中占比為55.35%，結果表明，鉻處理改變土壤細菌種群結構組成，大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭施加使受污染土壤恢復至無污染土壤水平。施用生物炭處理后擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）群落豐度增加，可能是由于生物炭孔徑結構對細菌起“庇護”作用，生物炭孔徑結構比土壤更豐富，更好為細菌提供居住場所，使大量細菌附著于生物炭表面。以上結果表明生物炭對土壤細菌種群結構具有一定積極影響。

圖7 細菌種群結構和物種豐度Fig.7 Bacterial population structure and species abundance

2.5 大豆秸稈生物炭與脫水污泥生物炭對土壤細菌屬影響分析

圖7b為每組土壤樣品中微生物在屬水平分布情況。通過各組土樣之間屬水平上物種多樣性比較可發現，鞘安醇桿菌屬（Sphingomonassp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）、交替赤桿菌屬（Altereryth?robactersp.）等生長狀況良好，可能是由于生物炭孔徑結構比土壤更易為細菌提供居住場所，使大量細菌附著于生物炭表面；紅育菌屬（Ramlibactersp.）、甘蔗糖菌屬（Saccharibacteria-genera-incer?tae-sedissp.）物種豐度呈下降趨勢，可能是因土壤中存在Cr（Ⅵ）污染，該菌屬對Cr（Ⅵ）敏感，導致部分菌屬處于被抑制狀態。這種現象可能與生物炭吸附選擇性有關。

試驗組1~4相比鞘安醇桿菌屬（Sphingomonassp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）、交替赤桿菌屬（Altererythrobactersp.）等在Cr（Ⅵ）污染土壤中均可生長，表明其強耐受能力；在本研究中鞘安醇桿菌屬、芽孢桿菌屬與交替赤桿菌屬等是污染土壤中優勢菌屬，且環境中Cr（Ⅵ）還原菌數量遠低于耐受菌，所以Cr（Ⅵ）耐受機制在環境中應用更廣泛。

3 討論與結論

生物炭結構、理化性質與結構功能關系，以及生物炭對土壤性質影響被大量研究[9]。生物炭在實際修復過程中對土壤微生物影響尚不明確。土壤微生物是土壤中生物群落重要組成且在土壤改良方面有重要作用[10]，是土壤健康重要指標[11-12]。本研究證明生物炭施加改變土壤群落豐度及多樣性，對細菌群落組成有顯著影響，且可恢復污染地區土壤微生物種類和豐度，促進污染地區土壤改良。生物炭因其固有多微孔結構、較大比表面積等特征，施入土壤后為細菌提供棲息場所并保護其生命活動[13]，促進微生物生長。

鞘安醇桿菌屬（Sphingomonassp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）、交替赤桿菌屬（Altererythrobactersp.）等是Cr（Ⅵ）污染土壤中優勢菌屬，這一結果與姜蒙研究重金屬污染土樣中篩選耐受細菌結果一致[14]；芽孢桿菌屬（Bacillusssp.）具有較強Cr（Ⅵ）還原性，與馮淏得出鉻耐受還原菌研究結果一致[15]；環境中Cr（Ⅵ）還原菌數量遠低于耐受菌，所以Cr（Ⅵ）耐受機制在環境中應用更廣泛，且研究表明，耐受Cr（Ⅵ）細菌往往可耐受多種其他重金屬[8]，說明Cr（Ⅵ）耐受菌在應對復合重金屬污染方面具有巨大潛能，本研究對重金屬耐受菌屬分離和篩選具有指導意義。不同來源生物炭處理使Cr（Ⅵ）污染土壤中細菌種群多樣性有所恢復，且由于生物炭制備來源不同，土壤中細菌種群多樣性恢復情況也不同。經兩種脫水污泥生物炭與大豆秸稈生物炭處理后Cr（Ⅵ）污染土壤中細菌種群多樣性均與未污染組相似，群落結構恢復至無污染水平，但仍有物種豐度呈下降趨勢細菌，可能是由于制備過程粗糙、原料來源不一，表面基團種類和性質有限等缺點造成，因此需通過改性方法賦予生物炭某些特性，提高生物炭對污染物去除效率，提升生物炭實際修復效果。

受污染地區植物生長狀況反映受污染地區修復程度及修復后土壤質量[16]，本研究中經兩種生物炭修復土壤中生長植物各項指標均顯著優于受污染土壤中植物各項指標，且是經D500修復后，植物長勢甚至優于未污染土壤中植物長勢。這可能與生物炭促進土壤中微生物豐度密切相關，微生物可促進土壤中營養物質積累，改善土壤性質從而促進植物生長。然而在實際修復過程中生物炭對微生物生長促進機制及對植物生長促進機制有待于進一步研究。

綜上所述，生物炭施加為微生物創造良好生存環境，提高土壤中微生物豐度，刺激微生物活動和生長，這有利于土壤有機質分解、提高土壤肥力、促進植物生長，對土壤生態環境具有積極意義。