解磷菌在復墾土壤中的定殖及促生效果研究

王向英，武欣，張杰，孟會生，洪堅平*

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西農業大學資源環境學院，山西太谷 030801）

采煤引起地表沉陷給礦區生態環境造成重大影響[1]，土地復墾是改善礦區生態環境、保護耕地面積、緩解人地矛盾的重要措施[2]。但工程復墾后的重構土壤，壓實嚴重、結構不良、土壤養分和酶活性低、微生物種類少，嚴重制約礦區植被生長和生態恢復[3-4]。相比傳統復墾方式投資大、周期長、生態效果不穩定等缺點，微生物復墾中許多微生物具有解磷、解鉀、固氮等功能，可改善植物營養環境，促進復墾土壤微生物體系恢復，加快復墾土壤向農業土壤轉變，縮短復墾周期[5-6]，是目前礦區土地復墾新熱點。

山西是煤炭大省，大量采煤沉陷地亟待復墾。同時，由于山西石灰性土質，磷在土壤中固定能力強，生物有效性低[7-8]，礦區土壤常因缺磷導致低固氮率，磷素養分成為提升復墾土壤質量的限制因素。解磷微生物可參與土壤中難溶磷的釋放與利用[9]，提高土壤有效磷含量，促進植物生長發育，是維持農業可持續發展重要手段[10]。目前，關于解磷微生物研究主要集中在解磷菌分離、篩選、解磷能力和解磷機理方面[11-12]，以及解磷菌劑施用后對土壤磷素活化和促生作用的評價[13-14]，對解磷菌在土壤中生存和定殖狀況不夠了解，有關解磷菌在復墾土壤中定殖情況鮮有報道。因此，有必要對解磷菌在復墾土壤中生態學特征深入研究，掌握定殖狀況，為充分發揮解磷作用，提升復墾土壤肥力提供理論依據。

熒光假單胞菌是一種重要根際促生菌[15]，具有抑制病原菌、解磷、固氮能力，可產生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體等促進植物生長[16-17]，在農業生產多有應用，但其在復墾土壤中定殖能力和促生作用尚不清楚。本文以綠色熒光蛋白（GFP）標記解磷假單胞菌w134和w137，通過盆栽試驗，研究w134GFP和w137GFP在玉米根際和非根際土壤中定殖以及對復墾土壤磷素活化和玉米生長的影響，以期為山西采煤塌陷區復墾土壤生物修復提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤為石灰性褐土，取自山西省襄垣縣采煤塌陷區的復墾土壤，pH 8.18，有機質8.4 g·kg-1，全氮0.32 g·kg-1，全磷0.35 g·kg-1，全鉀15.6 g·kg-1，堿解氮12.5 mg·kg-1，有效磷3.28 mg·kg-1，速效鉀84.7 mg·kg-1，取回土壤風干后過2 mm篩，混勻備用。

供試肥料：無機肥為尿素（N，46.6%），過磷酸鈣（P2O5，16%），硫酸鉀（K2O，45%）；有機肥為腐熟雞糞，其中含有機質27.8%，N 1.68%，P2O51.54%，K2O 0.82%。

供試作物為玉米，品種為大豐。

供試菌株為課題組從山西石灰性土壤中篩選的兩株解磷菌w134和w137，經16S鑒定，兩株菌均為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。質粒pRTGFP由南京農業大學（南農）鐘增濤教授惠贈，具有氨芐青霉素（Amp）和四環素（Tet）抗性[18]。采用電擊轉化法將pRTGFP質粒轉入w134和w137中，記作w134GFP和w137GFP。

標記菌定殖檢測：LB固體培養基滅菌后加入抗生素，制成50μg·mL-1氨芐青霉素和50μg·mL-1四環素的雙抗平板，平板計數法檢測標記菌在復墾土壤中定殖能力。

解磷細菌選擇性固體培養基（PVK培養基）[18]，用于計數復墾土壤中解磷菌群數量。

1.2 試驗設計

采用電擊轉化法進行w134和w137的GFP標記，隨后利用玉米盆栽試驗作定殖能力檢測。試驗在山西農業大學資源環境學院實驗站大棚中完成，將取回的復墾土壤風干過篩后裝盆，每盆10 kg。試驗為雙因素設計，4個施肥處理：不施肥、化肥（CF）、有機肥（M）、化肥+有機肥（CFM）；3個接菌處理：不接菌、w134GFP、w137GFP，共12個處理，每處理3個重復。按等量氮磷鉀原則施肥，化肥組：每盆施加尿素6.52 g，過磷酸鈣12.5 g，硫酸鉀6.66 g。有機肥組：每盆施加雞糞148 g。化肥+有機肥組：每盆施加肥料為化肥和有機肥各半。種植前將肥料作為底肥一次性施入。每盆接菌液50 mL，菌體濃度109cfu·mL-1，接菌后土壤中初始菌量0.5×107cfu·g-1土。澆水至土壤最大持水量，待水分平衡1 d后播種。玉米出苗7 d間苗，每盆留長勢一致的3株。出苗35d采集土樣和玉米植株測定各項指標。

1.3 測定項目與方法

復墾土壤中標記菌和解磷菌數量檢測：①根際土：采用抖根法收集根際土，取1 g根際土與9 mL無菌水混勻，逐級稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋度土壤懸濁液100μL涂LB雙抗平板；另取100μL涂PVK平板。30℃培養48 h，觀察根際土壤中標記菌和解磷菌群數量。②非根際土壤：取10 g非根際土與90 mL無菌水混勻，逐級稀釋，涂布方法同根際土，觀察非根際土壤中標記菌和解磷菌數量。

土壤速效磷采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法[19]，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法[20]。

玉米植株一次性采集，測定玉米株高、株粗和干鮮重。植株全氮采用硫酸—過氧化氫消煮，凱氏定氮法測定；植株全磷采用硫酸—過氧化氫消煮，釩鉬黃比色法測定[19]。

1.4 數據處理

試驗數據Excel 2016整理；利用SAS 9.4軟件作雙因素方差分析；并在雙因素方差分析基礎上采用Duncan多重比較法比較所有試驗處理間差異[21]，P<0.05。

2 結果與分析

2.1 復墾土壤中標記菌定殖能力和解磷菌群數量

試驗采用電擊轉化法將GFP質粒分別轉入w134和w137中，熒光顯微鏡可觀察到轉化菌體帶有強烈綠色熒光（見圖1），說明GFP質粒轉入w134和w137菌株中且GFP基因成功表達。w134GFP和w137GFP提質粒酶切后電泳見圖2，與南農惠贈GFP質粒酶切后條帶相同。再次證明GFP質粒已成功轉入w134和w137中，可作定殖能力相關研究。

圖1 w134GFP和w137GFP熒光照片（40×）Fig.1 Fluorescent photos of w134GFP and w137GFP(40×)

圖2 w134GFP和w137GFP質粒酶切電泳Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of plasmids w134GFP and w137 GFP

標記菌在玉米根際土壤中定殖數量在104cfu·g-1（見表1）。3個施肥組中標記菌定殖數量均大于不施肥組，定殖數量依次為：有機肥組>化肥組≈有機+化肥組>不施肥組。其中有機肥組中標記菌定殖數量最多，M+w137GFP定殖數量最高，約5.97×104cfu·g-1；M+w134GFP定殖數量次之，約3.94×104cfu·g-1，分別是單施w137GFP和w134GFP時定殖數量5.28倍和3.28倍。在非根際土壤中，除有機肥組標記菌定殖數量在104cfu·g-1外，其他處理中標記菌數量均在103cfu·g-1左右，比根際土中低一個數量級。

表1 玉米根際和非根際土壤中標記菌和解磷菌數量Table 1 Populations of w134GFP,w137GFP and phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere and non-rhizosphere soil of maize

解磷菌群數量在根際土中約107cfu·g-1，非根際土中約106cfu·g-1，根際土數量高于非根際土。與標記菌分布狀態一致，可見根際是微生物活動主要場所。不論施肥與否，有無標記菌接入，各處理間解磷菌群數量無數量級差異。

2.2 接種解磷菌對復墾土壤中有效磷含量、磷酸酶活性的影響

不同處理對土壤有效磷含量影響見圖3。接種解磷菌對復墾土壤有效磷含量影響顯著（P=0.02）。相同施肥條件下，接菌土壤比單施肥土壤有效磷含量高：CF+w134GFP比CF有效磷含量提高11.65%；M+w137GFP比M提高8.89%；CFM+w137GFP比CFM提高10.22%。12個處理中，土壤有效磷增幅最大是w134GFP和w137GFP，分別比CK中有效磷含量提高32.89%和16.44%。可見，解磷菌在4種施肥處理中均表現解磷功能，提高土壤有效磷含量。

圖3 不同處理條件下復墾土壤中有效磷含量Fig.3 Content of available phosphorus in reclaimed soil under different treatments

圖4為不同處理對土壤磷酸酶活性影響。盡管接種解磷菌對土壤磷酸酶影響不顯著（P=0.22），但接菌和施肥兩者交互作用對土壤磷酸酶影響顯著（P<0.05）。化肥+解磷菌處理的磷酸酶活性顯著低于單施解磷菌，有機肥+解磷菌處理的磷酸酶活性則高于單施解磷菌。所有處理中，CF+w137GFP處理的磷酸酶活性最低，而M+w134GFP處理的磷酸酶活性最高。可見，化肥對接種解磷菌分泌磷酸酶有抑制作用，有機肥表現促進作用。

圖4 不同處理條件下復墾土壤中磷酸酶活性Fig.4 Phosphatase activity in reclaimed soil under different treatments

2.3 接種解磷菌對苗期玉米生長的影響

從表2可知，接種解磷菌對玉米株高影響顯著（P<0.01），在相同施肥處理條件下，接種解磷菌處理比對應單施肥處理效果更佳：w134GFP和w137GFP處理的玉米株高比CK高5.5%~6.7%；CF+w134GFP和CF+w137GFP處理的玉米株高比CF高12.7%~15.8%；CFM+w134GFP和CFM+w137GFP處理的玉米株高比CFM高11.6%~18.4%。類似結果在玉米株粗、干鮮重上也有體現，表明四種施肥條件下，接種解磷菌均促進復墾土壤中玉米植株生長。

表2 不同處理條件下苗期玉米株高、株粗、干鮮重Table 2 Plant height,plant diameter,dry and fresh weight of maize under different treatments

2.4 接種解磷菌對玉米植株氮、磷含量的影響

玉米植株含氮量見圖5。接種解磷菌對玉米含氮量影響顯著（P=0.038），相同施肥條件下，w134GFP和w137GFP處理分別比CK含氮量提高32.05%和37.18%，差異顯著（P<0.05）。3個施肥組中，解磷菌+施肥處理比對應施肥處理玉米含氮高，其中M+w134GFP處理玉米含氮量最高，為3.07%，比M處理高18.1%。

圖5 不同處理條件下苗期玉米植株含氮量Fig.5 Nitrogen content of maize plant at seedling stage under different treatments

續表

不同處理條件下玉米植株含磷量見圖6。盡管接種解磷菌對玉米含磷量影響不顯著（P=0.08），但相同施肥條件下，接菌+施肥處理比對應單施肥處理的玉米含磷含量高。

圖6 不同處理條件下苗期玉米植株含磷量Fig.6 Phosphorus content of maize plant at seedling stage under different treatments

W134GFP和w137GFP處理分別比CK玉米含磷量提高27.96%和12.83%；CF+w134GFP和CF+w137GFP處理分別比CF提高14.28%和16.76%；M+w134GFP和M+w137GFP處 理 分 別 比M提 高54.9%和27.1%；CFM+w137GFP處理比CFM提高4.32%。

3 討論

3.1 標記菌在復墾土壤中的定殖

微生物定殖是指在有土著微生物參與競爭情況下，外來菌株在植物根表或土壤中生長并維持其種群數量的能力[22]。試驗借助GFP標記研究解磷假單胞菌w134和w137在復墾土壤中定殖能力。結果發現，接種35 d，w134GFP和w137GFP在玉米根際和非根際土壤中定殖數量基本在約103~104cfu·g-1（見表1），這與課題組前期僅在復墾土壤中35 d定殖數量一致，再次印證標記菌在復墾土壤中定殖能力。

本文所用解磷菌為熒光假單胞菌，作為一種重要根際促生菌[15]，其主要定殖在根際土壤中。夏楓耿等用luxAB發光酶基因標記熒光假單胞菌PF20001，發現其主要定殖在以菜心主根為中心，半徑3~4 cm土壤中[23]。張亮等研究發現熒光假單胞菌PEF-5#18可定殖于番茄根際，其定殖數量為根際土壤>根>莖[24]。劉方春等對假單胞菌YT3作綠色熒光蛋白標記發現，YT3-gfp主要定殖于櫻桃根際土壤中，根際土壤定殖數量是非根際土壤8.75~28.77倍[25]。本試驗得到相近結果，w134GFP和w137GFP在根際土壤中定殖數量高于非根際土。可見，復墾土壤的根際環境更利于菌株定殖，是熒光假單胞菌發揮其解磷、促生等功能主要場所。

外來微生物引入導致土壤原有微生物群落結構和功能發生變化，對生態系統產生正向或負向影響[26]，因此，功能菌株安全性備受關注。Glandorf等將基因修飾和未經修飾的假單胞菌引入田間栽培的小麥根部，發現接種的熒光假單胞菌對土壤微生物種群代謝能力、土壤硝化潛能和纖維素分解能力無影響，說明引入熒光假單胞菌對土壤微生物生態無顯著影響[27]。張亮等發現對接種熒光假單胞菌PEF-5#18對番茄根際土壤可培養細菌總數無顯著影響[24]。試驗證明，接入熒光假單胞菌（w134和w137）對土壤中解磷菌群數量無顯著影響（見表1），可見w134和w137是相對安全的功能菌，將在復墾區大田試驗中繼續探討未來其對復墾土壤微生物多樣性影響。

3.2 解磷菌對復墾土壤磷素活化和對苗期玉米生長的影響

研究報道添加解磷菌提高土壤速效磷含量，增加植株磷素積累量，增加產量或提高果實品質等。孟會生等研究發現解磷菌肥可提高復墾土壤中磷素有效性，提高玉米產量[7]。喬策策等將高效解磷菌NJAU-B8作盆栽和大田試驗發現，該菌有效促進苗期玉米生長，增加玉米產量[12]。Chen等從山西復墾土壤中篩選得到解磷菌S32，該菌株對難溶的有機磷和無機磷均表現較高溶解能力，可明顯提高復墾土壤中有效磷含量，顯著提高水稻植株生長量和吸磷量[13]。栗麗等研究發現，與未接種解磷菌處理相比，解磷菌劑促進磷礦粉和磷酸鈣在復墾土壤中磷的生物有效性，提高盆栽油菜磷素吸收[14]。

本試驗結果表明，單施解磷菌可促進玉米生長，增加玉米植株氮磷含量和土壤有效磷含量。而解磷菌+肥料大幅度增加標記菌定殖數量、玉米生長量和土壤有效磷含量。說明在復墾土壤中單施解磷菌效果有限，需提供相應營養，助其有效定殖。Ninwe等研究也證實，營養物質是影響熒光假單胞定殖首要因素[28]。復墾土壤養分貧瘠，添加肥料可為解磷菌提供良好載體以及碳、氮等營養物質，這些為解磷菌在土壤中有效定殖提供必要條件。因此，從定殖角度講，肥料有助于菌株定殖。僅定殖成功解磷菌才可持續發揮解磷作用，促進植物生長，實現復墾土壤向農業土壤轉變，縮短復墾周期。

4 結論

a.在玉米生長35 d后采集土壤，可從土壤中檢測到標記菌w134GFP和w137GFP，根際土壤中兩株標記菌數量約104cfu·g-1，非根際土壤中兩株標記菌數量約103cfu·g-1，說明解磷假單胞菌w134和w137可在復墾土壤中有效定殖。

b.接種w134GFP和w137GFP可提高復墾土壤中有效磷含量和磷酸酶活性，增加苗期玉米的株高、株粗、干鮮重以及玉米植株氮、磷含量，這兩株解磷菌可在復墾土壤中起到解磷與促生作用。

c.添加有機肥可為w134GFP和w137GFP提供良好營養條件，促進其在土壤中有效定殖和功能發揮。