結球甘藍無蠟粉亮葉性狀dCAPS標記引物優化

王超，付天姿，張曉烜，李秀樂

（東北農業大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

結球甘藍（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）簡稱甘藍，是十字花科蔬菜中重要一種。航海大發現時代傳播到世界各地，明清時期傳入我國[1]。初蓮香等1993年初次發現結球甘藍無蠟粉亮綠型突變體[2]，該種突變體甘藍在生長階段植被表面均無蠟粉覆蓋，與普通結球甘藍相比差異顯著。Justus和Stoner等報道指出，小菜蛾和部分鱗翅目昆蟲等害蟲在蕓薹屬無蠟粉植株上具有產卵偏好性[3-4]，但瓢蟲成蟲和卵數量有所增加[5]，該害蟲天敵在無蠟粉植株上移動速度快于有蠟粉植株，益蟲捕食能力提高使無蠟粉亮綠植株對蕓薹屬常見害蟲具有一定抗性[6]。Cole等研究發現，無蠟粉亮綠性狀對植株本身而言，增加對水脅迫敏感性，這一現象導致植株體內分泌阻止昆蟲取食化合物濃度升高[7]。此背景下，無蠟粉亮綠突變體研究對于抗蟲性等優勢甘藍品種選育具有重要意義。

多種分子標記技術已運用于結球甘藍無蠟粉亮綠性狀和目的基因定位相關研究，董昕探究甘藍顯性蠟質缺失基因BoGL-3定位與候選基因，通過BSA法篩選標記，利用F2群體驗證標記，將甘藍蠟質缺失基因BoGL-3定位在8號染色體末端83 kb區間內[8]。劉東明對甘藍蠟質缺失基因BoGL-4作精細定位，利用SSR標記精細定位，將目的基因BoGL-4定位在1號染色體170 kb區間內[9]。李景濤選用無蠟粉亮綠結球甘藍10Q-961和普通有蠟粉結球甘藍10Q-206為父母本，在對目的基因定位時，利用gSSR和InDel多態性引物篩選F2群體，最終試驗結果表明，共顯性標記Scaffold2324與突變體結球甘藍10Q-961基因gwl遺傳距離為6.5 cM[10]。

在現有分子標記手段中，單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）與其他標記方法相比，優勢在于其遺傳穩定性高、所在位點極具代表性且分布廣泛，已成為熱門分子標記方法之一[11]。除此之外，SNP檢測方法較多，雖然大部分檢測方法存在成本過高或操作繁瑣等缺陷，遺傳育種領域存在一定局限性[12-13]。但CAPS標記（酶切擴增多態性，Cleaved amplified polymorphic sequences）和衍生CAPS（衍生酶切擴增多態性，Derived cleaved amplified polymorphic sequences，dCAPS）是可將SNP多態轉化成可酶切擴增的有效分子標記方法[14]。已有報道中司文潔[15]、王彩芬[16]和雷天剛[17]等研究證明，CAPS標記具有對DNA用量低、操作方便、共顯性明顯和多態性好等優點，故在模式植物擬南芥[18]、大田作物小麥[19]和大麥[20]及水果蔬菜作物中應用廣泛。dCAPS標記開發具有一定復雜性，且因限制性內切酶多樣性，dCAPS引物設計變得極其耗時，Li等開發批量開發工具（http://223.65.208.206.8018/）可直接設計引物對，且提供引物錯配等級[21]，還可使用Neff等開發dCAPS Finder 2.0軟件（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm）設 計dCAPS引 物[22]，該方 法 使dCAPS引物開發更方便快捷。

綜上，dCAPS標記自發明以來憑借其位點多、高效快捷等特點在分子研究方面應用廣泛，例如基因定位、品種品系鑒定、圖位克隆等方面。本試驗開展結球甘藍dCAPS分子標記輔助育種，利用新概念分子育種理論和技術體系，實現從經驗育種到高效育種的轉變，進而加快結球甘藍新品種選育進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

結球甘藍蠟質缺失突變材料“亮葉98-1030”，結球甘藍蠟質正常的野生型材料“98-1030”，以及其有性雜交F1、F2代單株。材料表型如圖1所示，植株表現為亮葉色、有光澤，葉片表面和莖均無白色或灰白色粉狀蠟質覆蓋，則為無蠟粉亮葉突變型植株；植株表現為灰綠色，葉片表面和莖上均有一層白色霜狀蠟質，葉脈表現為白色或黃白色，則為有蠟質正常型植株。以上材料均由東北農業大學園藝園林學院甘藍課題組提供，同年同一時期播種于溫室。

圖1 野生型98-1030及無蠟粉亮葉突變體98-1030對比Fig.1 Comparison of wild-type cabbage 98-1030 with bright-leaf mutant without wax powder

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗

試驗材料于2019年春播種于東北農業大學園藝實驗站溫室內，待兩葉一心時分苗于單個營養缽中并編號；在苗齡3~4片真葉時，調查性狀，根據表型性狀分離比作卡方檢驗。將編號植株分別取0.2 g，保存于-80℃條件下，備用。

1.2.2 親本基因重測序及候選SNPs挖掘

將結球甘藍野生型98-1030和無蠟粉亮葉突變型98-1030構建DNA文庫作全基因組重測序，并篩選測序結果，與參考基因組作比對（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10901?genome_assembly_id=59537），利用比對結果檢測和篩選SNPs并注釋統計，以上部分由深圳華大基因股份有限公司完成。最后使用IGV軟件將測序所得的親本基因與參考基因組作比對，獲取目標區間SNPs。

1.2.3 dCAPS引物的設計

基于篩選得到的20個SNP位點設計dCAPS引物：先利用dCAPS Finder 2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm）設計dCAPS標記錯配引物，再利用Premier 5.0設計dCAPS標記下游引物。錯配引物設計原則為上下游引物在23~25 bp之間，錯配堿基數為一個，PCR產物條帶在150~400 bp之間。上述引物均由北京睿博興科生物技術有限公司合成，以PAGE方式純化。

1.2.4 dCAPS多態性引物篩選

dCAPS引物多態性篩選具體步驟為：

（1）采用改良CTAB法提取雙親以及F1的DNA，并利用設計好的dCAPS引物作PCR擴增；

（2）記錄PCR產物電泳帶型，以條帶清晰、易于識別、可穩定擴增為篩選條件，使用對應限制性內切酶酶切，最后統計酶切產物條帶情況，篩選目標引物。

2 結果與分析

2.1 結球甘藍無蠟粉亮葉98-1030遺傳模式分析

試驗所選5個F1單株全部表現為顯性野生性狀，于2018年4月開始授粉，6月獲得F2代，同年7月播種于溫室，分別編號，8月統計表型。F2代材料表現型分為無蠟粉亮葉型和表面蠟質正常型兩類，表型性狀統計結果為，無蠟粉亮葉型和表面蠟質正常型比例接近1∶3.95，經卡方檢驗（x2=10.65>x20.05=3.841）與孟德爾3∶1分離比例相差較大。此現象可能是因為F2群體較小，且僅來自3株F1植株造成。本課題組牟香麗等試驗結果證明結球甘藍98-1030無蠟粉亮葉控制基因為一對隱性基因控制的質量性狀[23]，遵循孟德爾遺傳定律。

2.2 DNA提取與檢測

按照改良CTAB方法提取野生型98-1030、突變型無蠟粉亮葉98-1030、F1及F2群體基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，DNA樣品條帶如圖2所示，條帶清洗、無降解、無拖尾，證明DNA樣品提取質量較高，可開展下一步試驗，將提取后DNA原液放置-20℃溫度下保存，使用時稀釋5倍作為工作液用于PCR擴增。

圖2 主要材料DNA檢測結果Fig.2 DNA test results of main materials

應注意的是，PCR產物和酶切產物檢測方法不同。PCR產物檢測步驟為，待PCR反應完成后，配置濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，以120 V電壓電泳，時長20 min。PCR產物酶切電泳方法為：待酶切完成后，配置濃度為3%瓊脂糖凝膠，以80 V電壓電泳，時長1.5 h。

2.3 基于雙親轉錄組測序SNP分析

利用雙親全基因組重測序比對分析發現，一些可能影響基因功能的SNP分布情況如下：6 652個SNP參與密碼子的提前終止；1 395個SNP將終止密碼子替換為其他氨基酸殘基，使該SNP所在DNA片段翻譯出更長開放閱讀框；還有2 442個SNP可改變基因組上的剪接供體及受體位點；9 325個SNP導致甲硫氨酸殘基改變。最后根據測序結果注釋信息在目標區間內篩選出20個SNPs篩選dCAPS引物。

2.4 dCAPS標記轉化

根據親本基因組重測序結果在目標區域內選擇20個SNP位點，將其轉化為dCAPS標記，得到20對可用于PCR擴增，擴增片段包含特異性酶切位點dCAPS引物，分別編號為DC01~DC20。

以引物DC01為例，設計方法和原理見圖3，該引物所使用限制性內切酶AvaII識別序列為GGW?CC，序列中W為A和T簡并堿基國際通用代碼。

圖3 dCAPS引物DC01設計Fig.3 Design of primer DC01 for dCAPS

所設計上下游引物序列及所對應限制性內切酶見表1，表中加粗斜體字母為錯配堿基。

表1 根據SNP位點設計的dCAPS引物Table 1 dCAPS primers designed according to SNP

2.5 dCAPS標記篩選

將20對dCAPS引物開展野生型結球甘藍98-1030和無蠟粉亮葉突變型結球甘藍98-1030以及F1代PCR擴增及酶切。PCR結果表明，有10對引物可擴增出產物條帶；酶切驗證結果顯示，有8對引物經限制性內切酶酶切后產生多態性。

圖4為PCR擴增后產物條帶情況概述。圖4A中1號引物（ND07）和3號引物（ND12）為可開展后續酶切驗證的引物；2號引物（ND08）擴增出多條條帶，故舍去；4號引物（ND13）無清晰的擴增產物，故舍去。圖4B中1號引物（ND06）可穩定擴增，2號引物（ND16）顯性親本無條帶，故舍去。

圖4 部分dCAPS標記PCR擴增產物Fig.4 PCR products by dCAPS molecular markers

由于dCAPS標記中酶切位點一般包含于上游引物中，酶切產物即部分PCR產物被酶切得來，所以多態性差異較小，長度僅為20 bp。因酶切產物片段過于短小，在瓊脂糖凝膠電泳中跑出凝膠區域，共顯性酶切產物標記中一般僅存在2個條帶片段，如圖5所示。

圖5 Sty I酶切產物檢測結果Fig.5 Sty I digested product

酶切篩選后8對dCAPS引物為：DC03、DC04、DC06、DC07、DC11、DC12、DC16和DC19，轉化效率為40%，可用于后續基因定位研究。

3 討論

傳統正向遺傳學（Forward genetics）基因定位方法一般是構建遺傳連鎖圖譜，但存在定位區間較大、定位精確性低等缺陷，且正向遺傳學步驟過程繁瑣，耗時較長[24]。近年來，隨著第二代測序技術飛速發展，高通量測序技術逐漸成熟，測序成本降低，更多方便快捷的基因定位方法被開發。

SNP（Single nucleotide polymorphism）即單核苷酸多態性，是指基因中單個堿基發生轉換、顛換等突變，共有4種突變形式：C-T（G-A）、T-A（A-T）、C-G（G-C）、C-A（G-T），但第一種突變形式頻率最高，約占全部突變頻率67%[25]。理論上來說，將CAPS和dCAPS相結合，可檢測任意SNP位點[26]。但在SNP轉化dCAP標記中，引物能否轉化成功是關鍵，引物中錯配堿基數以及錯配位置距離引物3'端遠近，均決定dCAPS標記開發能否成功。Neff等研究擬南芥探索試驗中發現，當插入錯配堿基在3'端第二位或者距離第二位更遠位置時，可成功將限制性酶切位點引入引物中[22]。在PCR擴增時使用不同DNA聚合酶得到的PCR擴增結果可能會不同[26]，PCR擴增時選用的DNA聚合酶不應具有校正功能，否則影響錯配堿基插入，無法擴增PCR產物或者無法正常插入酶切位點。因本試驗所選取SNP位點前后堿基均不存在酶切位點，無法直接設計得到CAPS引物，所以采用dCAPS標記方法篩選引物和優化。但部分dCAPS引物錯配堿基距離3'端位置較近，可能導致部分PCR擴增效果差。本試驗所選用DNA聚合酶為2×EsTaqMas?terMix酶，不具有高保真性，因此在DNA聚合時可保證順利擴增及后續試驗。

Di等研究玉米dCAPS標記開發檢測時利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法作酶切產物分離[27]。但聚丙烯酰胺凝膠相較于瓊脂糖凝膠電泳而言，不僅制作過程復雜，且耗時久，故不推薦使用。可使用高分辨率瓊脂糖凝膠檢測酶切產物，Shahinnia等大麥dCAPS標記開發中利用高分辨率Metaphor瓊脂糖凝膠[28]；Yanagisawa等在小麥dCAPS分子標記中則利用另一種高分辨率Nusieve GTG瓊脂糖凝膠[19]。與本試驗所用普通瓊脂糖凝膠相比，高分辨率瓊脂糖雖效果較好，但價格過于昂貴，標記開發成本升高。

本試驗所建立SNP/dCAPS轉化體系基因定位方法在甘藍作物中鮮有記載，本研究增加普通瓊脂糖凝膠電泳濃度，利用降低電泳電壓，延長電泳時間方法對差異較小酶切產物分離片段，達到經濟實惠、操作簡單且有效的目的。

4 結論

本試驗根據野生型結球甘藍98-1030和突變型98-1030的基因組重測序數據所得的非同義SNP位點作為基礎，設計20對dCAPS引物，利用雙親及F1代作引物篩選及優化，最終篩選出8對PCR產物清晰、酶切后可產生特異性片段的共顯性dCAPS標記：DC03、DC04、DC06、DC07、DC11、DC12、DC16、DC19，標記轉化率為40%。研究結果可為后續基因定位及結球甘藍優良品種選育奠定理論基礎。