西瓜種質(zhì)資源背景選擇標記篩選及遺傳多樣性分析

欒非時，閆令文，劉樹森，劉釗，高鵬，宋正峰，朱子成，劉宏宇

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；3.山東省壽光市三木種苗有限公司，山東壽光 262704；4.濰坊科技學(xué)院農(nóng)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，山東壽光 262799）

西瓜是我國重要水果型蔬菜之一，在園藝作物生產(chǎn)中具有重要地位[1]。西瓜種質(zhì)資源是新品種選育物質(zhì)基礎(chǔ)，西瓜種質(zhì)遺傳背景狹窄一直是限制我國西瓜育種發(fā)展重要因素[2]。傳統(tǒng)育種手段周期長、見效慢、連鎖累贅難以消除，利用分子標記輔助背景選擇，可加快遺傳背景恢復(fù)速度，縮短育種周期[3-4]。在分子水平上研究西瓜種質(zhì)資源親緣關(guān)系，將極大降低遺傳背景相似的組合，提高育種科學(xué)性與可行性，因此篩選一套用于西瓜背景選擇的分子標記，研究西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性，將為今后西瓜育種提供理論基礎(chǔ)。

背景選擇對象范圍廣，幾乎遍布作物基因組。因此在開展背景選擇時，應(yīng)盡可能選用均勻分布在染色體上的分子標記[5]。簡單重復(fù)序列（Sim?ple sequence repeat，SSR）標記技術(shù)具有多態(tài)性高、操作簡單、對DNA質(zhì)量要求低等優(yōu)勢[6]，廣泛應(yīng)用于園藝作物背景選擇、遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜、品種鑒定等研究[7-8]。王振選用331對SSR引物對玉米兩親本開展擴增，篩選出多態(tài)性較高的SSR引物60對作背景選擇，BC2F1群體背景回復(fù)率平均值為87.36%[5]。張兆輝等篩選出21對SSR引物，擴增82份瓠瓜種質(zhì)資源，將其分為三大類群[9]。段紅梅利用198對SSR引物，篩選出均勻覆蓋在大豆全基因組上的51對SSR引物研究背景選擇效果，結(jié)果表明20對引物與51對引物背景選擇效果相似[10]。劉基生等選用200對SSR引物，對101份甘藍材料作標記，篩選得到36對多態(tài)性較高引物，最終將供試材料分為8個類群，并選出23份具有代表性自交系材料[11]。董冬利用覆蓋小麥全基因組114對SSR引物，篩選出多態(tài)性較高SSR引物46對用于遺傳背景回復(fù)率分析，BC1F2個體遺傳回復(fù)率平均為76.2%[12]。武向斌在美洲南瓜全基因組上開發(fā)38 104個SSR標記，利用66對SSR引物，將61份南瓜種質(zhì)材料聚為野生種和栽培種兩大類[13]。張慕月利用23對SSR引物，分析276份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性，將供試材料聚為5個類群[14]。史建磊等選用37對SSR引物對48份黃瓜材料擴增，將這些材料聚為4類[15]。

本研究在446對SSR引物中篩選出在西瓜11條染色體上分布相對均勻、多態(tài)性較高的110對SSR引物，建立一套用于西瓜背景選擇的分子標記，結(jié)合聚類分析、群體結(jié)構(gòu)分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析等方法，研究81份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性，為篩選培育西瓜新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗81份西瓜種質(zhì)材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子遺傳育種團隊保存。按照西瓜屬分類方法，將81份西瓜種質(zhì)材料分為5類變種，西瓜種（C.lanatus）69份，毛西瓜變種（C.lanatus var.lanatus）8份，飼用西瓜變種（C.colo?cynthis var.citroides）1份，藥西瓜種（C.colocynthis）2份，熱迷西瓜種（C.rehmii）1份，81份西瓜種質(zhì)材料信息（見表1）。

表1 81份西瓜種質(zhì)資源信息Table 1 Information on 81 watermelon germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 田間試驗方法

①植株管理

試驗材料于2019年3月下旬種植于黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽實驗實習(xí)與示范基地5號大棚。采取隨機區(qū)組試驗設(shè)計，每份材料種植5株，株行距80 cm×50 cm，每個小區(qū)間種植京穎作為保護行。取81份西瓜種質(zhì)材料種子，每份10粒，紗布包裹，標明材料名稱。溫湯浸種12 h，32℃恒溫箱中催芽，待80%種子露白后，使用營養(yǎng)缽育苗，播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心1號溫室。5月上旬定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽實驗實習(xí)與示范基地大棚內(nèi)，采用吊蔓栽培，雙蔓整枝，人工授粉，為避免營養(yǎng)競爭，每株僅留1個瓜，正常田間管理，授粉45 d后收獲西瓜果實，并測定性狀指標。

②果實性狀調(diào)查

本研究調(diào)查81份西瓜種質(zhì)材料9種農(nóng)藝性狀，包括果實重量、果實長度、果實寬度、果皮厚度、中心果肉可溶性固形物含量、果肉可溶性固形物含量、種子長度、種子寬度、種子厚度。具體方法參照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[16]。

1.2.2 分子試驗方法

①DNA提取

在幼苗期采集幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取西瓜供試樣品DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，100μL ddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②SSR引物合成和PCR擴增

本試驗446對SSR引物由北京市農(nóng)林科學(xué)院許勇研究員團隊提供，由上海生工生物工程公司合成。

PCR反應(yīng)10μL體系：DNA模板（30 mg·L-1）1μL，上游引物（10μmol·L-1）0.5μL，下游引物（10μmol·L-1）0.5μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）1.0μL，dNTP（25 mmol·L-1）0.15μL，TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.1μL，ddH2O 6.75μL。

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

退火溫度確定：根據(jù)設(shè)計的退火溫度作篩選，若結(jié)果偽帶、雜帶較多可適當提高退火溫度，若條帶較淡或空白可適當降低退火溫度。

③電泳

PCR產(chǎn)物中加入2.5μL10×Loading Buffer，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，恒壓200 V，電泳2 h，使用銀染法染色并拍照記錄數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

讀取擴增后清晰條帶，在相同遷移位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“-”，不同引物擴增結(jié)果構(gòu)成原始的“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣。將田間已測定果實性狀輸入Microsoft Excel 2019軟件，并計算各性狀平均值、標準差。頻率分布在SPSS 22軟件中完成。運用Popgen 32軟件計算遺傳多樣性參數(shù)，利用PIC-CALCVer-sion 0.6軟件計算多態(tài)性信息含量（PIC）值，利用軟件NTSYS-pc 2.10，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA），對供試材料作聚類分析。利用TASSEL 5.0軟件中GLM一般線性模型將81份西瓜種質(zhì)資源表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)結(jié)合后，開展全基因組關(guān)聯(lián)分析。

續(xù)表

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜農(nóng)藝性狀表型分析

頻率分布直方圖見圖1。結(jié)果表明，果實重量頻率變化為1.00~13.80 kg，果實長度頻率變化為12.00~35.00 cm，果實寬度頻率變化為10.60~32.30 cm，果皮厚度頻率變化為0.30~4.00 cm，中心果肉可溶性固形物含量頻率變化為2.00~12.50，近皮果肉可溶性固形物含量頻率變化為1.60~11.60，種子長度頻率變化為7.74~12.51 mm，種子寬度頻率變化為4.37~10.52 mm，種子厚度頻率變化為1.54~3.89 mm，9個表型性狀符合正態(tài)分布。變異系數(shù)主要反映某一性狀數(shù)值，9個表型性狀變異情況見表2，果實重量和果皮厚度變異系數(shù)最大，均為48%，果實寬度變異系數(shù)最小，為17%。按變異系數(shù)可將西瓜9個表型性狀變異程度分為小（CV≤25%）、中（25%

表2 西瓜9個農(nóng)藝性狀表型分析Table 2 Phenotypic analysis of nine agronomic traits in watermelon

圖1 9個西瓜表型性狀頻次直方圖Fig.1 Histogram for the nine watermelon phenotypic traits

2.2 SSR引物篩選及多態(tài)性分析

運用446對SSR引物對16份具有代表性西瓜種質(zhì)材料作擴增，篩選出110對帶型清晰、多態(tài)性高SSR引物，覆蓋西瓜11條染色體，每條染色體均分布10對引物，占總引物數(shù)24.7%。再用110對SSR引物對81份種質(zhì)材料作基因分型。經(jīng)PCR擴增后DNA片段長度為100~330 bp，共計得到清晰可辨認條帶8 250條，這些引物對所有種質(zhì)材料擴增結(jié)果多態(tài)性豐富、條帶清晰且特異性高。110對引物多態(tài)性分析結(jié)果見表3。

表3 110對SSR引物多態(tài)性信息Table 3 Polymorphism of 110 pairs of SSR primers

在81份西瓜種質(zhì)材料中共檢測到335個等位基因，等位基因數(shù)變化為2~8個，平均為3.4個。其中BVWS00209等位基因數(shù)最多（8個）。有效等位基因數(shù)變化為1.17~5.53，平均為1.97。（PIC）值變化為0.25~0.80，平均為0.40，其中，BVWS00209多態(tài)性最高，為0.80。觀測雜合度變幅為0.32~1.00，平均為0.93。Shannon信息指數(shù)變幅變化為0.28~1.58，平均為0.76。綜合數(shù)據(jù)指標表明110對SSR引物多態(tài)性良好，有效揭示81份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性。

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

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2.3 聚類分析

利用NTSYS-pc2.10軟件，以遺傳相似系數(shù)采用UPGMA方法聚類（見圖2）。結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.68時，81份西瓜種質(zhì)材料可分為兩大類群。第一類群包括69份西瓜種質(zhì)材料，均為西瓜種（C.lanatus）。第二類群共12份西瓜種質(zhì)材料，包括8份毛西瓜變種（C.lanatus var.lanatus）、2份藥西瓜種（C.colocynthis）、1份飼用西瓜變種（C.lanatus var.citroides）、1份熱迷西瓜種（C.rehmii），因此根據(jù)進化樹節(jié)點位置細分，又可將第二類群分為3個亞群，第一亞群將熱迷西瓜種Grif16135單獨聚為一類，第二亞群將2份藥西瓜種PI532738和PI179881聚為一類，第三亞群將8份毛西瓜變種PI296341、PI500308、PI482362、綠子砧木西瓜、PI271775、PI 459074、PI482255、PI508443和1份飼用西瓜變種PI482322-1聚為一類。

圖2 81份西瓜種質(zhì)資源聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 81 watermelon germplasm resources

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 5.0軟件中GLM一般線性模型，將110對SSR標記與81份西瓜種質(zhì)資源9個表型性狀作全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到與西瓜種質(zhì)資源9個表型性狀關(guān)聯(lián)SSR標記109個，根據(jù)Bonferroni檢驗，P0.05=0.05/335=0.00014925，P0.01=0.01/335=0.00002985，分別取負對數(shù)為3.826和4.525，將p≤10-5（-LogP≥3.826）作為關(guān)聯(lián)分析中標記與性狀之間顯著關(guān)聯(lián)閾值，全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4。所檢測到109個SSR標記中，有5個標記與3個農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)，BVWS00589、BVWS00209與果皮厚度相關(guān)，分別位于4號和9號染色體（見圖3）。BVWS00544、BVWS02384與中心果肉可溶性固形物含量相關(guān)，分別位于11號和6號染色體（見圖4）。BVWS00807與種子厚度相關(guān)，位于4號染色體（見圖5）。

圖3 果實厚度曼哈頓圖Fig.3 Manhattan plot of fruit thickness

圖4 中心果肉可溶固形物含量曼哈頓圖Fig.4 Manhattan plot of soluble solids content in central pulp

圖5 種子厚度曼哈頓圖Fig.5 Manhattan plot of seed thickness

表4 西瓜3個性狀顯著關(guān)聯(lián)SSR標記Table 4 SSR markers of three traits in watermelon were significantly associated

3 討論與結(jié)論

3.1 背景選擇標記篩選

分子標記輔助背景選擇關(guān)鍵是獲得在基因組上分布相對均勻且數(shù)量充足的分子標記，由于隨背景選擇標記數(shù)增加，在準確度增加同時試驗成本也大幅增加，因此，針對特定植物材料和選擇時期，需確定適宜數(shù)量的背景選擇標記[11]。Hospi?tal等研究表明全基因組背景選擇需適宜標記數(shù)為每100 cM 2~3個標記，在此基礎(chǔ)上增加標記數(shù)，效果并不顯著[17]。劉基生等在甘藍背景選擇中使用標記密度為平均每條染色體9.8個[11]。夏軍紅等在玉米背景選擇中使用標記密度為平均每條染色體7.1個[18]。本研究在西瓜11條染色體上均分布10個標記，標記數(shù)量較為適宜，可用于西瓜背景選擇工作。

3.2 西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

SSR標記因其自身優(yōu)點，廣泛適用于種質(zhì)材料遺傳多樣性分析[19]。Wang等通過SSR標記分析61份西瓜材料遺傳多樣性，結(jié)果表明引物多態(tài)性在供試種質(zhì)資源間差異較大且栽培品種多態(tài)性普遍較低[20]。石磊等用31對SSR引物分析50份西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性，等位基因數(shù)平均為1.46個，Shannon多樣性信息指數(shù)平均為0.73[21]。徐彥剛等利用45對SSR引物分析78份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性，平均等位基因數(shù)1.98，平均PIC值0.41[22]。本研究遺傳多樣性分析結(jié)果高于易麗聰?shù)鹊玫降钠骄銤庑畔⒅笖?shù)0.43和平均PIC值0.23[23]。低于王準等得到的平均等位基因數(shù)6.05個和平均PIC值0.49[24]，高于趙勝杰等得到的平均PIC值0.31[25]。本研究在西瓜全基因組開發(fā)的446對SSR引物中篩選出110對引物，多態(tài)性信息含量（PIC）變化為0.25~0.80，平均0.40，篩選的SSR引物多態(tài)性較高，但與前人開發(fā)的西瓜23對核心引物對比，部分引物多態(tài)性較低，可能因選取的供試材料以西瓜種居多，且大多數(shù)為栽培種，僅少數(shù)為野生種，說明SSR引物多態(tài)性不僅受引物特性限制，還可能與群體大小、種類、標記數(shù)量有關(guān)。雖然西瓜已篩選出23對核心引物并有效用于西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，但背景選擇需在每條染色體上分布充足且相對均勻的標記才可開展，所以本研究在全基因組開發(fā)標記中，初步建立一套分布廣且多態(tài)性高標記作為西瓜背景選擇標記。

3.3 遺傳多樣性分析

程莉莉等利用26對SSR引物對383份玉米種質(zhì)材料作聚類分析，將供試材料分為6大類[26]。本研究聚類分析結(jié)果表明，81份西瓜種質(zhì)被分為兩大類群，大部分西瓜種質(zhì)材料被劃分到第一類群中，均為西瓜種，說明西瓜種間親緣關(guān)系較近。藥西瓜種與熱迷西瓜種、毛西瓜變種、飼用西瓜變種被劃分到第二類群中，說明其親緣關(guān)系較近，且兩群體親緣關(guān)系明顯較遠。通過聚類分析表明，供試材料在分子水平分類結(jié)果與西瓜屬分類存在一定相關(guān)性。同時，猜測這兩大類群親緣關(guān)系較遠的原因可能是第一類群中西瓜材料多為栽培種，第二類群西瓜材料多為野生種所致。

3.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究檢測到與果皮厚度顯著關(guān)聯(lián)標記2個，分別位于4號和9號染色體，檢測到與中心果肉可溶性固形物含量顯著關(guān)聯(lián)標記2個，分別位于6號和11號染色體，檢測到與種子厚度顯著關(guān)聯(lián)標記1個，位于4號染色體上，與郭祿芹對西瓜全基因組作關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致[27]。程瑤利用花園母本和LSW-177構(gòu)建重組自交系作QTL分析，共檢測到控制可溶性糖含量5個QTL，分布在2號、6號、7號和9號連鎖群上[28]；周慧文等利用PI186490和LSW-177構(gòu)建F2群體，對種子大小作QTL分析，檢測到與種子厚度相關(guān)QTL 2個，分別位于3號和6號連鎖群[29]。比較發(fā)現(xiàn)，通過QTL定位到的QTL位點與本研究關(guān)聯(lián)分析檢測到標記結(jié)果存在差異，原因可能是環(huán)境條件不同，如生長時期澆水量、光照、溫度等變化影響西瓜糖含量形成和植物各器官發(fā)育，表型測定準確性也對關(guān)聯(lián)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。另一方面，可能與試驗群體有關(guān)，多數(shù)研究者選擇F2或重組自交系，而本試驗選用自然群體，自然群體中個體間親緣關(guān)系或亞群結(jié)構(gòu)影響均可能造成關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的差異。