利用ARTP選育真姬菇高產菌株*

李春霞，劉靜雯，李欣悅，王竟夷，黃 亮，班立桐，孫 寧，王 玉

（天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus） 又名蟹味菇、斑玉蕈等，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 玉蕈屬 （Hypsizigus）[1]。真姬菇在栽培過程中菌絲生長速度慢、生長周期長、易受栽培環境的影響[2]，且栽培基質中含有大量木質素和纖維素，在降解纖維素前必須先降解木質素，漆酶在木質素的降解過程中起主要作用[3-4]。近年來，許多研究者開始借助平板篩選法以獲得木質素降解酶活性高的菌株以期縮短食用菌生長周期[5-6]。通過采用平板篩選獲得木質素降解酶活性高的菌株，旨在為真姬菇工廠化栽培提供新的優質菌株，提高子實體產量。

常壓室溫等離子體誘變技術（atmospheric room temperature plasma,ARTP） 可以使微生物表面電勢下降或者改變細胞膜的通透性，導致遺傳物質發生損傷，生物細胞中容錯率高的SOS修復機制啟動，使得調控網絡、造成遺傳物質及代謝途徑發生改變[7-8]。與傳統誘變技術相比，ARTP誘變技術具有普適、高效、快速、安全、無污染等優點[9]；ARTP誘變技術近年來廣泛應用于細菌、放線菌、霉菌[10-14]，此外，在食用菌菌株篩選及育種工作中也有應用[15-16]。通過對真姬菇菌株原生質體的常壓室溫等離子體誘變技術進行探索，以篩選出漆酶高產菌株，可為規模化的真姬菇生產提供助力。

1 材料及方法

1.1 試驗菌株

真姬菇菌株（編號O-T），保藏于天津農學院食用菌研發中心。

1.2 主要培養基

PDA培養基、RB-PDA培養基、再生培養基配方見參考文獻[17-18]。

羧甲基纖維素鈉培養基（CMC-Na培養基） 配方見參考文獻[19]；LBL液體培養基配方見參考文獻[20]。

1.3 主要儀器及試劑

木聚糖：山毛櫸木木聚糖純度90%，上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素，上海生工生物工程有限公司；ABTS，北京索萊寶科技有限公司；溶壁酶lywallzyme，廣東微生物研究所研制。

ARTP-M常壓室溫等離子體育種機，無錫思清源生物科技公司；EnSpire多功能酶標儀，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.4 原生質體制備

原生質體制備參照參考文獻[21]并稍加改動，稱取15 mg溶壁酶溶于1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，用接種環挑取適量菌體于0.6 mol·L-1的甘露醇溶液中清洗，清洗后的菌體用無菌濾紙迅速擦干放入酶液中，30℃酶解3 h，酶解結束后2 000 r·min-1離心5 min，用移液槍吸取上清，用0.6 mol·L-1的甘露醇溶液重新懸浮，用塞脫脂棉的無菌注射器純化原生質體，400倍下用血球計數板計數，并將原生質體濃度稀釋為1×106個/mL，添加終濃度為5%的甘油作為保護劑，得到的原生質體懸浮液用于ARTP誘變。

在預試驗的基礎上，采用單因素試驗分別研究酶解溫度（28℃、30℃、32℃、34℃）、酶解時間（2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h）、滲穩劑種類（甘露醇、蔗糖、氯化鉀、硫酸鎂）、溶壁酶的濃度 （10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1）對原生質體產量的影響。

1.5 常壓室溫等離子體誘變

利用常壓室溫等離子體育種機對真姬菇原生質體進行誘變，原生質體懸浮液的上樣量為10 μL，誘變功率為120 W，輻照距離2 mm，氣體流速10 L·min-1，誘變時間梯度分別為 0、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s，每個梯度3組重復，將誘變后的原生質體懸浮液用0.6 mol·L-1的甘露醇原生質體滲透壓穩定劑稀釋并涂布于再生培養基中，計算致死率。原生質體致死率（F，%）的計算公式為：

式中：A為對照平板菌落數（個）；B為誘變后存活菌落數（個）。

1.6 菌株篩選

1.6.1 菌株初篩

待再生培養基上長出零星小菌落時，將菌落挑至PDA培養基上，距離菌落1 cm處斜插入無菌蓋玻片，25℃培養，待邊緣菌絲生長至蓋玻片2/3處時取出鏡檢，區分單核菌株和雙核菌株，測定誘變后的雙核菌株的菌絲生長速度、濃密度、潔白度、邊緣整齊度；挑選優勢菌株分別接種于RB-PDA培養基及以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的平板培養基中，分別篩選出產漆酶和纖維素酶酶能力較高的優勢菌株。

1.6.2 菌株復篩

采用LBL液體培養基進行液體培養，25℃、180 r·min-1搖床培養20 d后于615 nm下測定吸光度，計算脫色率 （decolorizing rate，DR）。脫色率（DR，%） 的計算公式為：

式中：A為菌株培養后培養基的吸光度值；B為空白培養基的吸光度值。

1.7 真姬菇栽培料中的酶活性分析

1.7.1 粗酶液提取

取真姬菇后熟期58 d的栽培料為酶活測定的試驗材料，稱取6 g栽培料置于50 mL離心管中，加入30 mL蒸餾水，30℃水浴2 h，過濾，離心，上清液為粗酶液。

1.7.2 漆酶酶活測定

向96孔板中依次加入0.15 mL的50 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液 （pH 4.2）、50 μL 酶液、0.1 mL 的1 mmol·L-1ABTS，以滅活30 min的酶液為對照。使用酶標儀測定420 nm處5 min內的吸光度變化。定義每分鐘轉化1 μmoL ABTS所需的酶量為一個活力單位。酶活力（E，U·mL-1）的計算公式為：

式中：N為酶液稀釋倍數；V1為漆酶酶活測定反應體體系的終體積；V2為反應添加的酶液體積；OD420為t時間內反應液在420 nm處吸光度的增加值；3.6×104為420 nm處ABTS氧化態的摩爾吸光系數（L·mol-1cm-1）；T為反應時間（min）；L為96孔板孔的高度（cm）。

1.7.3 纖維素酶測定

纖維素酶測定方法參照參考文獻[22]。

1.7.4 木聚糖酶活性測定

木聚糖酶測定方法參照參考文獻[22]。

1.8 數據處理

應用Excel軟件處理數據，通過SPSS 23.0軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 真姬菇原生質體的酶解條件研究

2.1.1 酶解溫度對真姬菇原生質體產量的影響

溫度主要影響溶壁酶活性及細胞壁的生理狀態[23]，酶解溫度對真姬菇原生質體產量的影響具有顯著性差異，見圖1。

圖1 酶解溫度對原生質體產量的影響Fig.1 Effect of enzymatic temperature on protoplast yield

如圖1所示，隨著溫度升高，原生質體產量先增加后降低，酶解溫度為32℃時，原生質體產量最大為4.50×106個/mL；酶解溫度為34℃時，原生質體產量略有降低，為4.30×106個/mL，原生質體產量下降，原因可能為酶活性略有降低，酶解效果降低，但2種酶解溫度下，原生質體產量無顯著性差異，故篩選出來的最佳酶解溫度為32℃。

2.1.2 酶解時間對真姬菇原生質體產量的影響

不同酶解時間下真姬菇原生質體的產量見圖2。

圖2 酶解時間對原生質體產量的影響Fig.2 Effect of enzymatic time on protoplast yield

圖2結果表明酶解時間對真姬菇原生質體產量的影響具有顯著性差異。在溶壁酶的作用下，真姬菇菌絲體逐漸變軟，原生質體從菌絲尖端逐漸開始釋放，隨著酶解時間的增加，原生質體產量先增加后略微降低。酶解3.5 h時釋放的原生質體最多，達到4.70×106個/mL；隨著酶解時間的增加，原生質體產量降低，降低原因可能是由于菌絲體酶解完全，溶壁酶導致原生質體破裂，故3.5 h是最佳的酶解時間。

2.1.3 滲穩劑種類對真姬菇原生質體產量的影響

滲穩劑對維持反應體系中原生質體的滲透壓穩定性至關重要[24]，滲穩劑種類對真姬菇原生質體產量的影響結果見圖3。

圖3 滲穩劑種類對原生質體數量的影響Fig.3 Effect of the type of osmotic stabilizer on the number of protoplasts

如圖3所示，以甘露醇作為滲穩劑時，真姬菇原生質體產量達到最大為6.12×106個/mL；以蔗糖作為滲穩劑時，原生質體產量最少為2.92×106個/mL；以硫酸鎂和氯化鉀作為滲穩劑時，兩者對真姬菇原生質體的產量低且無顯著性差異，故真姬菇菌絲體酶解的最佳滲穩劑為0.6 mol·L-1甘露醇。

2.1.4 溶壁酶濃度對真姬菇原生質體產量的影響

不同溶壁酶濃度對真姬菇原生質體產量的影響結果見圖4。

圖4 溶壁酶濃度對原生質體產量的影響Fig.4 Effect of different lysozyme concentration on protoplast yield

如圖4所示，不同溶壁酶濃度對真姬菇原生質體產量的影響具有顯著性差異。隨著溶壁酶濃度的增加，真姬菇原生質體產量逐漸增加，其原因是由于酶分子與菌絲體的接觸增加，而當酶濃度為25 mg·mL-1時，原生質體產量達到最大，為 6.75×106個/mL，酶濃度在20 mg·mL-1時，原生質體產量為5.18×106個/mL，在節約溶壁酶用量，且能達到誘變要求（懸浮液純化后原生質體數量為106個/mL） 的前提下[18]，選用的溶壁酶濃度最佳為20 mg·mL-1。

2.2 真姬菇原生質體誘變條件的研究

誘變試驗結果見圖5。

圖5 不同誘變時間對原生質體致死率的影響Fig.5 Effect of different mutagenesis time on the fatality rate of protoplast

如圖5所示，隨著誘變時間的增加，原生質體的致死率逐漸升高。誘變時間為100 s時，原生質體致死率達到90.3%。挑選致死率達到90%以上時仍存活的菌落于PDA培養基中。

2.3 雙核菌絲篩選結果

常壓室溫等離子體誘變共獲得290株再生菌株，鏡檢結果確定雙核菌株288株，單核菌株2株。采用雙核菌株進行菌株篩選，雙核菌絲鏡檢圖見圖6。

圖6 雙核菌絲鏡檢圖Fig.6 Microscopy figure of dikaryotic mycelium

如圖6所示，圖中箭頭指示為鎖狀聯合菌絲，即表明所觀察菌株為雙核菌株。

2.4 菌株初篩結果

2.4.1 菌株生長速度篩選結果

通過測定菌絲生長速度、濃密度、潔白度、邊緣整齊度共獲得30株菌絲生長速度大于出發菌株，其篩選結果見表1。

表1 誘變菌株和菌株O-T菌絲生長情況Tab.1 Mycelium growth of mutant strains and strain O-T

由表1可知，獲得了30株菌絲生長速度大于出發菌株O-T、且濃密度、潔白度高且邊緣整齊，其中22株誘變菌株的生長速度與出發菌株O-T之間具有顯著性差異。

2.4.2 產酶能力較高的菌株篩選結果

將上述30個誘變菌株分別用于產纖維素酶和產漆酶能力的篩選，試驗結果見表2。

表2 產酶能力較高的菌株篩選結果Tab.2 Screening results of strains with high enzyme production capacity

由表2可知，7株誘變菌株在以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養基中的生長速度高于突變株，其中菌株M-105、M-50、M-65、M-212、M-56的生長速度與出發菌株O-T相比具有顯著性差異。通過觀察RB-PDA平板中的顏色變化情況，篩選出產漆酶能力較高的菌株4株，分別為菌株M-50、M-48、M-96、M-133，其中菌株M-50產2種酶的能力均高于出發菌株。

2.4.3 拮抗試驗結果

將2.4.2中得到的產漆酶及纖維素酶能力較高的10株菌株及出發菌株O-T進行拮抗試驗，結果見表3。

表3 拮抗試驗結果Tab.3 Antagonistic test results

如表3所示，出發菌株O-T與誘變菌株M-94、M-96、M-53、M-133之間無拮抗反應，誘變菌株M-65與菌株M-94、M-48、M-133之間無拮抗反應。

2.5 菌株復篩

LBL液體培養檢測結果見表4。

表4 11個菌株LBL脫色檢測結果Tab.4 LBL decolorization test results of 11 strains

如表4所示，菌株M-212、M-96、M-50的脫色率顯著高于出發菌株O-T。劉洋等[25]研究表明，顯色反應與真姬菇產量具有一定相關性，培養基顏色越淺，脫色率越高，表明該菌株的結實性越好。

2.6 栽培料中的漆酶、纖維素酶、木聚糖酶活力結果分析

以真姬菇栽培過程中后熟期58 d的栽培料為試驗樣品，測定復篩得到的誘變菌株M-212、M-50、M-96及出發菌株O-T的產酶能力，酶活力測定結果見表5。

表5 4個菌株酶活力測定結果Tab.5 Results of enzyme activity of 4 strains

由表5可知，3株誘變菌株產漆酶能力及產木聚糖酶能力均顯著性高于出發菌株O-T，表明這三株菌株降解木質素、半纖維素的能力較強；菌株M-212、M-50降解纖維素的能力顯著高于出發菌株OT，誘變菌株M-96降解纖維素的能力略弱于出發菌株O-T。

3 結論

首次采用常壓室溫等離子體誘變技術對出發菌株O-T的原生質體進行誘變，由于原生質體無細胞壁，對外界誘變條件敏感，等離子體對原生質體誘變效率高。原生質體數量對誘變結果有很大影響，通過單因素試驗篩選得到的最佳滲穩劑為0.6 mol·L-1甘露醇、最佳酶解溫度為32℃、最佳酶解時間為3.5 h、最佳酶濃度為20 mg·mL-1，原生質體數量最大可達到6.75×106個/mL，足以滿足誘變需求，該試驗結果與已有的文獻結果略有差異[18,26]，造成的原因可能是不同菌株對溶壁酶的耐受能力有差別。

共獲得誘變后產纖維素酶能力高的菌株7株，產漆酶能力高的菌株4株，但與平菇等（Pleurotus ostreatus）[27-28]相比，真姬菇菌株在產漆酶能力的平板篩選試驗中變色不明顯。采用2種平板篩選方法來篩選優勢菌株，操作簡便，結果直觀。近年來，諸多研究者[29-30]采用LBL脫色檢測來判斷菌種退化程度，趙楚楚等[31]對LBL菌種質量評價方法進行了機理初探，表明發酵液變色與BTB作用活性物質的含量差異有關；劉洋等[25]研究表明LBL評價方法可對與真姬菇菌種質量相關的多個性狀指標進行整合評價，進一步證明了該方法的可靠性，且LBL質量評價方法操作簡便，具有較好的時效性，可更好的節約育種時間。

真姬菇在營養生長過程中會產生大量漆酶降解栽培基質以滿足自身生長發育的需求，陳輝等[32]對真姬菇不同生長發育時期的酶活力進行測定，發現大多數漆酶基因的表達量在后熟40 d～60 d時持續提高。通過考察后熟58 d的真姬菇栽培料中的酶活力，并以此為依據驗證篩選出優勢菌株；所得優勢菌株的產漆酶能力明顯高于出發菌株O-T，進一步驗證了其在基質降解轉化能力上的優勢，有利于菌株生長過程中營養轉化。