組蛋白H3K27me3介導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制*

袁樹珍 隋曉露 顧鳳娟 張艾莎 許云鵬 謝婷妃 曾啟城 鄒杰鋒 陳繼紅

廣東醫(yī)科大學(xué)深圳寶安臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省深圳市 518100

足細(xì)胞損傷是腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。表觀遺傳修飾參與足細(xì)胞損傷的過程，組蛋白甲基化水平變化導(dǎo)致炎性反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄過程及多個(gè)相關(guān)信號(hào)通路活化異常，破壞足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)及其功能，導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡[1]。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶同源序列增強(qiáng)子2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)催化組蛋白H3K27發(fā)生三甲基化，EPZ-6438是EZH2的抑制劑，降低組蛋白H3K27me3水平，抑制炎性基因和超氧化物歧化酶表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)和延緩腎小球疾病的進(jìn)展[2]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與凋亡及炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，能被多種代謝產(chǎn)物激活，引起炎癥因子表達(dá)增多，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，在多種腎臟疾病中發(fā)揮重要作用[3]。JAK2/STAT3信號(hào)通路活化可促進(jìn)EZH2的表達(dá)，并且STAT3與EZH2的啟動(dòng)子區(qū)相互結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞增殖等生理過程。本研究選用小鼠腎足細(xì)胞MPC5，給予EPZ-6438干預(yù)處理，觀察足細(xì)胞組蛋白H3K27me3及JAK2/STAT3信號(hào)通路水平變化，探討組蛋白H3K27me3介導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 小鼠腎足細(xì)胞MPC5，購(gòu)自深圳市拓普生物科技公司。DMEM培養(yǎng)基，EZH2抑制劑(EPZ-6438)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自ThermoFisher公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，RIPA裂解液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 小鼠腎足細(xì)胞MPC5用10%胎牛血清(FBS)、1%青鏈霉素混合液DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，當(dāng)足細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)收集細(xì)胞。PBS潤(rùn)洗，加入1ml 0.25%胰酶消化處理，按1/3比例傳代，傳2個(gè)10cm2平皿放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。隨機(jī)分對(duì)照組及EZH2-組。EZH2-組給予EPZ-6438 10μm 培養(yǎng)48h。對(duì)照組給予等量PBS培養(yǎng)48h。

1.3 Western Blot法檢測(cè)足細(xì)胞組蛋白H3K27me3 收集細(xì)胞，加RIPA裂解液裂解30min，離心取上清液。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白量，調(diào)整蛋白濃度為6μg/μl，上樣電泳，電壓80V跑膠25min，160V跑膠50min。取出蛋白凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(200mA，2h)。脫脂牛奶封閉后加入H3K27me3抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，采用Image J軟件分析靶蛋白帶的灰度水平。

1.4 qPCR 法檢測(cè)足細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA 收集細(xì)胞，用Buffer RZ提取足細(xì)胞總RNA，參照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自ThermoFisher公司)說明書合成cDNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物序列見表1，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15min，95℃變性10s、60℃退火延伸30s、72℃延伸30s共45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

表1 JAK2、STAT3的引物序列

1.5 Western Blot法檢測(cè)足細(xì)胞p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白 收集細(xì)胞，加RIPA裂解液裂解30min，離心取上清液。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白量，調(diào)整蛋白濃度為6μg/μl，上樣電泳，電壓80V跑膠25min，160V跑膠50min。取出蛋白凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(200mA，2h)。脫脂牛奶封閉后加入一抗(p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、內(nèi)參抗體，1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜。加入二抗(1∶10 000)室溫2h后進(jìn)行顯色，采用Image J軟件分析靶蛋白帶的灰度水平。

1.6 ChIP-chip技術(shù)檢測(cè)組蛋白H3K27me3靶基因及富集分析 (1)文庫(kù)構(gòu)建：收集兩組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用免疫磁珠結(jié)合細(xì)胞完成分選，使用ChiTag促進(jìn)H3K27me3抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合。Trizol法提取兩組DNA，使用Nanodrop檢測(cè)DNA的純度，使用Qubit對(duì)DNA進(jìn)行定量。對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，修復(fù)DNA片段及添加測(cè)序接頭后完成純化，完成文庫(kù)構(gòu)建。(2)文庫(kù)質(zhì)檢和測(cè)序：使用Agilent 2100 對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)，排除接頭二聚體污染，使用q-PCR 對(duì)測(cè)序文庫(kù)濃度進(jìn)行定量，保證樣品純度，文庫(kù)質(zhì)檢合格后于Illumina平臺(tái)測(cè)序獲取靶基因。(3)組間差異富集峰統(tǒng)計(jì)：使用MACS/PePr軟件進(jìn)行組間富集峰Peak數(shù)目統(tǒng)計(jì)。(4)數(shù)據(jù)分析：利用MACS2軟件對(duì)兩組樣品進(jìn)行富集分析(閾值設(shè)定為P≤0.05)，將富集峰與基因結(jié)構(gòu)元件進(jìn)行基因組位置比較，確定與富集峰有直接關(guān)系的基因集進(jìn)行基因注釋。(5)GO富集分析：將富集峰相關(guān)基因集通過向GO數(shù)據(jù)庫(kù)各Term形成映射，完成Term定位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)得到在生物過程、細(xì)胞組成和分子功能方面富集的GO項(xiàng)目上Peak重疊基因的條目和分布情況。(6)KEGG富集分析：將富集峰相關(guān)基因集通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)得到在差異表達(dá)基因中顯著性富集的信號(hào)通路，并確定信號(hào)通路中呈現(xiàn)顯著性富集的基因靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞組蛋白H3K27me3水平 EZH2-組足細(xì)胞組蛋白H3K27me3蛋白表達(dá)水平為0.85±0.12，對(duì)照組為1.25±0.08，EZH2-組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007<0.05)。見圖1。

圖1 組蛋白H3K27me3蛋白表達(dá)Western Blot電泳圖

2.2 JAK2/STAT3信號(hào)通路目標(biāo)基因mRNA水平 與對(duì)照組相比，EZH2-組足細(xì)胞JAK2、STAT3mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組足細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA水平

2.3 JAK2/STAT3信號(hào)通路目標(biāo)蛋白水平 與對(duì)照組相比，EZH2-組足細(xì)胞JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 兩組足細(xì)胞p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白水平

圖2 JAK2/STAT3信號(hào)通路目標(biāo)蛋白表達(dá)Western Blot電泳圖

2.4 組間差異富集峰統(tǒng)計(jì) 組間差異富集峰Peak數(shù)目統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)EZH2-組有6 919條富集峰，對(duì)照組有3 273條富集峰，兩組各列舉前15條。見表4。

表4 兩組間差異富集峰(Peak)統(tǒng)計(jì)

2.5 組蛋白H3K27me3調(diào)控靶基因GO富集分析 靶基因功能主要集中在生物過程、細(xì)胞組成、分子功能方面(P≤0.05)。見表5，圖3。其中涉及生物過程中Pigu基因呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控。見表6。

表6 JAK/STAT信號(hào)通路靶基因GO富集分析

2.6 組蛋白H3K27me3調(diào)控靶基因KEGG富集分析 靶基因參與調(diào)控信號(hào)通路主要集中在細(xì)胞溶質(zhì) DNA 感應(yīng)途徑、Rap1信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路和 JAK/STAT 信號(hào)通路。見表7，圖4。其中靶基因IL12rb1、IL5ra呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT 信號(hào)通路調(diào)控。見表8。

表8 JAK/STAT信號(hào)通路靶基因KEGG功能富集分析

3 討論

足細(xì)胞損傷是腎小球疾病發(fā)生進(jìn)行性腎小球硬化和腎纖維化的重要因素，其發(fā)病機(jī)制包括[4-5]：(1)血流動(dòng)力學(xué)變化使血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平增加改變足細(xì)胞蛋白表達(dá)及分布直接損傷足細(xì)胞；(2)RAS系統(tǒng)激活可通過促進(jìn)鈣離子內(nèi)流和活性氧生成導(dǎo)致足細(xì)胞損傷；(3)氧化應(yīng)激反應(yīng)通過擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，激活足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激系統(tǒng)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷；(4)表觀遺傳修飾調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程導(dǎo)致炎性反應(yīng)基因及多個(gè)相關(guān)信號(hào)通路活化促進(jìn)足細(xì)胞凋亡等。其中，表觀遺傳修飾在足細(xì)胞損傷機(jī)制具有重要作用。

表觀遺傳修飾是指非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、非編碼RNA等。組蛋白甲基化是發(fā)生在N端H3和H4氨基酸殘基上的甲基化，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成，維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用。EZH2是EZH基因編碼的組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，是多梳抑制復(fù)合體2(PRC2)的一個(gè)催化亞基，聚集至啟動(dòng)子區(qū)域，催化組蛋白 H3K27發(fā)生三甲基化抑制靶基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控下游炎癥反應(yīng)信號(hào)通路活化過程[6]。EZH2活性減弱使組蛋白H3K27me3水平下降，對(duì)microRNA抑制作用減弱，由microRNA調(diào)控的抗氧化劑抑制劑硫氧還蛋白互作蛋白(TxnIP)表達(dá)增加，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷足細(xì)胞，提示組蛋白H3K27me3修飾水平變化參與足細(xì)胞損傷過程[7]。

足細(xì)胞損傷與多條信號(hào)通路異常活化相關(guān)，如p38MAPK信號(hào)通路、TGF-β/Smad信號(hào)通路、 NLRP3炎癥小體信號(hào)通路[8]，其中JAK2/STAT3信號(hào)通路在足細(xì)胞分化、凋亡過程中起重要作用。JAK2是非受體型胞漿酪氨酸蛋白激酶，通過與受體偶聯(lián)介導(dǎo)細(xì)胞因子相關(guān)信號(hào)的傳遞。STAT3是DNA結(jié)合蛋白，與磷酸化酪氨酸的肽段結(jié)合被磷酸化形成二聚體，進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子序列的特定位點(diǎn)結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄[9]。體內(nèi)p-STAT3過表達(dá)可上調(diào)EZH2活性顯著增強(qiáng)組蛋白H3K27me3表達(dá)水平，抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，提示組蛋白H3K27me3可能通過介導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)通路參與細(xì)胞分化、凋亡過程。

圖4 組蛋白H3K27me3調(diào)控靶基因KEGG分類

本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，EZH2-組足細(xì)胞H3K27me3蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；JAK2/STAT3信號(hào)通路目標(biāo)基因JAK2、STAT3mRNA 表達(dá)顯著增加(P<0.05)；JAK2/STAT3信號(hào)通路目標(biāo)蛋白JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；組蛋白 H3K27me3 調(diào)控靶基因 GO 富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因功能主要集中在生物過程、細(xì)胞組成、分子功能方面，其中涉及生物過程中 Pigu 基因呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控；組蛋白H3K27me3 調(diào)控靶基因 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因參與調(diào)控信號(hào)通路主要集中在細(xì)胞溶質(zhì) DNA 感應(yīng)途徑、Rap1 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路和 JAK/STAT 信號(hào)通路，其中靶基因IL12rb1、IL5ra呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT 信號(hào)通路調(diào)控。組蛋白H3K27me3介導(dǎo) JAK2/STAT3信號(hào)通路致足細(xì)胞損傷的可能機(jī)制如下：(1)p-STAT3屬于核轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)過程。EZH2是PRC2中的一個(gè)催化亞基，聚集至啟動(dòng)子區(qū)域。在各種刺激因素下，足細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)子區(qū)域EZH2的核定位能力減弱及其活性下降，細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K27me3水平下降，使其染色體結(jié)構(gòu)處于疏松狀態(tài)，增強(qiáng)了p-STAT3與基因啟動(dòng)子的結(jié)合，對(duì)TGF-β基因等促纖維化關(guān)聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱[10], 與腎臟纖維化相關(guān)的炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子如血小板源生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor)、IL-1β、IL-18等產(chǎn)生增多，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。(2)白細(xì)胞介素5受體(IL5ra)基因編碼IL5受體的α鏈，該受體依賴腫瘤壞死因子(TNF-α)激活相關(guān)信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡過程[11]。炎癥因子TNF-α與IL5受體結(jié)合激活JAK/STAT通路，執(zhí)行細(xì)胞外基質(zhì)重塑和細(xì)胞凋亡。(3) 磷脂酰肌醇多糖錨定生物合成類(Pigu)基因編碼糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)酰胺酶(GPI-T)復(fù)合物的第5亞基，GPI-T主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并催化GPI錨定蛋白合成，GPI錨定蛋白是一類由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖鏈共價(jià)結(jié)合的復(fù)雜糖復(fù)合物，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。Pigu基因過度表達(dá)能上調(diào)GPI錨定蛋白水平激活JAK/STAT通路，參與細(xì)胞增殖過程[12]。(4) Pigu、IL5ra、TGF等多個(gè)基因調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路活化過程[13]。代謝產(chǎn)物與酪氨酸激酶相關(guān)受體結(jié)合激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，組蛋白H3K27me3水平下降對(duì)靶基因抑制作用減弱，Pigu 、IL5ra、TGF等多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)促進(jìn)JAK2酪氨酸磷酸化作用增強(qiáng)，JAK2激活后催化受體酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾與周圍的氨基酸序列形成停泊位點(diǎn)(docking site)，募集更多含有SH2結(jié)構(gòu)域的STAT3蛋白到這個(gè)停泊位點(diǎn)。STAT3蛋白發(fā)生磷酸化修飾水平明顯增強(qiáng)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與促纖維化等基因結(jié)合，上調(diào)TGF-β1、α-SMA等蛋白的表達(dá)，造成細(xì)胞外基質(zhì)堆積及足細(xì)胞損傷[14]。

本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)給予組蛋白甲基化酶抑制劑干預(yù)，足細(xì)胞組蛋白 H3K27me3 表達(dá)下調(diào)，JAK2/STAT3信號(hào)通路表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)組蛋白 H3K27me3靶基因富集分析提示組蛋白 H3K27me3通過調(diào)控靶基因Pigu、IL12rb1、IL5ra參與JAK2/STAT3信號(hào)通路活化，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。