肝癌代謝重編程相關基因富集分析及ATP檸檬酸裂解酶表達的臨床意義

周青青，李軍建，鄭亦胡，余正平，朱千東

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.手術室，2.肝膽胰外科）

我國是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）的高發國家。在HCC病程中，抑癌基因失活、原癌基因激活及基因突變效應積累等都對HCC發生、發展具有顯著誘發和促進作用。最新研究表明，調控腫瘤形成與進展的一個關鍵因素是腫瘤細胞代謝重編程（metabolic reprogramming）[1]，該過程重新界定了腫瘤細胞代謝網絡內營養物質的通量與流向，用以滿足腫瘤細胞物質代謝和能量代謝，保證腫瘤細胞的存活與增殖，在不利條件下保持生存優勢[2]。這些代謝改變為細胞提供核酸、蛋白質等大分子合成所需要的中間代謝物，對于腫瘤的發生和進展至關重要。因此，系統性地研究代謝重編程相關基因表達在HCC預后和治療中的靶標作用意義重大。在本研究中，我們首先分析了來源于TCGA（The Cancer Genome Atlas）的公共大樣本數據，通過富集分析篩選獲得參與HCC腫瘤進展的代謝重編程相關基因；其次，在候選基因中ATP檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）作為腫瘤細胞脂質代謝通路上游的關鍵酶，在許多腫瘤的發生和進展中具有重要作用，因此我們在HCC臨床標本中檢測ACLY表達水平，并納入GEO（gene expression omnibus）的大樣本表達數據和臨床數據進一步研究，明確ACLY表達在HCC生存預后中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 TCGA數據：下載數據庫中所有374例HCC測序數據（截止2019年9月），將其中50對HCC與癌旁配對樣本納入差異表達分析。標本以編號區分腫瘤組織或癌旁組織，基因表達數據為level 3級別。該測序數據完成于Illumina HiSeq 2000測序平臺。

1.1.2 GEO數據：下載數據庫中基因芯片數據集GSE14520，該數據集包括247 例HCC基因芯片數據和臨床數據。本研究排除26 例樣本：其中22 例樣本隸屬GPL571 平臺，5 例無臨床結果數據（1 例隸屬GPL571 平臺，并且無結果數據）。最后，隸屬GPL3921 平臺的221 例基因芯片數據被納入最終分析。所有肝組織標本均來自2002年至2003年在復旦大學附屬肝癌研究所和中山醫院接受根治性切除的患者[3-4]，隨訪數據和術前檢查數據較完整。

1.1.3 人HCC組織標本的選取：組織標本和癌旁組織標本來自溫州醫科大學附屬第一醫院2018年5月至10 月間因原發性HCC行肝切除術的15 例病例的HCC組織標本及癌旁組織，其中男11 例，女4 例，年齡37～78歲，平均55.8歲。術前未接受放療、化療等治療，術中均未見遠處轉移，術后經病理證實為HCC，其中高分化7例，中分化6例，低分化2例。所有患者均簽署知情同意書，本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 基因富集分析：本研究采用的基因富集方法包括GSEA（gene set enrichment analysis）、GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）。GSEA無需先找差異基因，計算的基本原理是掃描排序序列，當出現一個特定功能基因集中的基因時，就增加該功能集富集評分（enrichment score，ES）值，反之，就減少ES值，所以在整個掃描過程中，ES是一個動態的值，可以避免一些人為篩選差異基因導致的偏倚。GO可分為分子功能（molecular function）、生物學過程（biological process）和細胞組分（cellular component）三個部分，分別對基因進行注釋和分類。我們通過應用Cytoscape軟件和BiNGO插件進行分析[5-6]。KEGG通路富集分析以KEGG通路為單位，應用統計學檢驗，在整個基因組背景中找出差異表達基因中顯著性富集的通路。此分析同樣需要篩選出候選的差異基因列表。在本研究中，我們通過在線網絡工具KOBAS[7]（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）進行此分析。

1.2.2 樣本總RNA提取及qRT-PCR檢測：按照Invitrogen公司Trizol試劑盒說明書進行操作，提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA有無降解，檢測所提取RNA的濃度和純度，RNA的A260/A280在1.8～2.0 范圍內者方可進行后續實驗。根據反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄合成cDNA，避光保存于-20 ℃冰箱。以此cDNA為模板，GAPDH為內參，熒光定量PCR反應使用SYBR法Q-PCR試劑盒在BIORAD CFX96 熒光定量PCR儀上操作。PCR反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；55 ℃ 30 s，共35個循環。最后采用2-△△Ct方法計算基因相對表達值。引物委托上海生物工程公司合成，序列如下：ACLY（F’TC GGCCAAGGCAATTTCAGAG，R’CGAGCATACTT GAACCGATTCT）；GAPDH（F’GTCTTCACCACCA TGGAGAAG，R’CAAAGTTGTCATGGATGACCTT GG）。

1.3 統計學分析

TCGA RNAseq數據通過R軟件（http://www.rproject.org/，version 3.2.5），采用R包“edgeR”包來構建表達矩陣，評估組內和組間差異，進行差異表達基因分析，獲得差異表達基因列表；基因分析納入標準raw read counts＞1，差異表達基因篩選標準為：錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05，log CPM＞1 且|差異倍數（fold change，FC）|＞3。GEO數據分析首先根據ACLY表達值將樣本分為高表達組和低表達組，生存分析和Cox比例風險模型分析過程采用R包“survival”；后者先進行單因素Cox回歸分析，再將差異顯著的進行多因素Cox回歸分析。其他數據統計分析采用SPSS23.0統計軟件進行。兩組數據間統計差異的比較采用獨立樣本t檢驗；各個臨床因素與ACLY表達值組成差異采用χ2檢驗；P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 GSEA分析獲得與HCC代謝重編程相關的差異表達基因

通過構建表達矩陣、基因ID轉基因名稱等步驟獲得全基因表達譜列表，包含27 915 個基因，該列表滿足GSEA的分析要求。本研究篩選差異最顯著的3條代謝通路進行下一步研究（表1）。

表1 在HCC癌旁組中富集最顯著的代謝相關通路

2.2 GO分析獲得與HCC代謝重編程相關的差異表達基因

篩選全基因表達譜列表，獲得1 720個差異表達基因，其中表達上調的基因1 052個，表達下調的基因668個（圖1）。經GO分析，本研究選擇差異最顯著3個代謝相關生物學過程（表2）納入后續研究，共包含122個基因。

表2 腫瘤組織和癌旁組織差異最顯著的代謝相關生物學過程通路

圖1 腫瘤組織和癌旁組織差異表達基因的熱圖（A）和火山圖（B）

2.3 KEGG通路分析獲得與HCC代謝重編程相關的差異表達基因

在http://kobas.cbi.pku.edu.cn/網站輸入差異表達基因列表，參數選擇：Databases:KEGG pathway；Statistical test method:hypergeometric test/Fisher’s exact test；FDR correction method:Benjamini and Hochberg，差異最為顯著的KEGG通路見表3，其中metabolic pathways包含200個差異表達基因，用于后續研究。

表3 腫瘤組織和癌旁組織差異最顯著的KEGG通路

2.4 聯合分析篩選獲得HCC代謝重編程相關基因

單獨應用GSEA、GO或者KEGG分析存在偏倚的可能性，我們將上述3 種富集分析方法獲得的代謝重編程相關的差異表達基因取交集，獲取共同的代謝重編程相關的差異表達基因，共有26個基因（圖2），其中表達上調的差異基因8個，表達下調的基因18個。

圖2 篩選獲得26個代謝重編程相關基因

2.5 HCC患者腫瘤組織與癌旁組織中ACLY基因表達

為了驗證ACLY在HCC臨床樣本中的表達豐度，我們采用qRT-PCR的方法檢測了15對HCC組織和癌旁組織的標本，結果表明，HCC組織ACLY表達值顯著高于癌旁組織（P＜0.01）（圖3）。

圖3 qRT-PCR檢測15對HCC組織與癌旁組織表達情況（**P＜0.01）

2.6 GEO大樣本數據生存分析和臨床相關性研究驗證

為了明確ACLY高表達在HCC患者預后中的作用，我們納入GEO大樣本數據予以驗證，該組基線數據較完整（表4）。我們首先提取GEO組表達數據，顯示ACLY在HCC組織的表達值高于癌旁組織（P＜0.01）（圖4）。

圖4 HCC組織樣本ACLY表達量顯著高于癌旁組織（**P＜0.01）

根據ACLY表達中位數，將臨床HCC樣本分為高表達組和低表達組（由于部分數據缺失，每個的臨床指標數目略有差異）。臨床相關分析因素包括：性別、年齡、乙肝狀態、谷丙轉氨酶水平（＞50 U/L/≤50 U/L）、主瘤直徑（＞5 cm/≤5 cm）、多發病灶、肝硬化、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期、AFP水平（＞300 ng/mL/≤300 ng/mL）。分別統計了與ACLY表達相關的因素（表4），及其在HCC生存預后中的作用（圖5，表5、6）。

表5 HCC總體生存率Cox回歸分析

圖5 ACLY高表達及低表達組患者總體生存率比較（A）與無復發生存率比較（B）

表4 HCC代謝重編程相關基因ACLY表達與臨床指標的相關性

3 討論

HCC是常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率在惡性腫瘤中均位居前列[8]。在臨床上通常采用病理指標指導腫瘤分期，選擇治療方法和分析患者生存預后，其中腫瘤血管侵犯、分化程度、大小和數目、TNM分期、BCLC分期及CLIP分期等都是影響HCC預后的重要因素[9]。隨著分子生物學的進展，相關研究顯示HCC的發生和進展實質上是一個動態變化的過程，包括抑癌基因失活、原癌基因激活、基因突變效應積累等[10-11]。因此，許多研究者試圖運用特定基因表達變化來進行腫瘤的分型和預后評估，預測腫瘤的發生、復發和轉移等。許多癌癥相關分子的異常表達與患者預后密切相關，是腫瘤預后的

獨立危險因素[12-13]，這些分子同樣包括了部分代謝相關基因。代謝相關基因在腫瘤細胞中異常表達，廣泛參與腫瘤的侵襲、轉移等生物學行為，并可能是癌癥患者生存預后的指標和治療靶點。

表6 HCC無復發生存率Cox回歸分析

目前，已有大量分析腫瘤差異表達基因的高水平研究發表，幾乎涵蓋了所有腫瘤類型，但是這些研究并不限定于特定的腫瘤表型，尤其是分析HCC代謝重編程相關基因本研究是屬首次。另外，在以往類似的研究中，往往通過分析基于基因芯片的表達數據，篩選差異候選分子，難以保證1:1 的配對，從而影響了數據的完整性和可信度。此外，基因芯片等來源的表達數據通常需要進行大規模的qRT-PCR來驗證候選分子的表達值。而已有研究報道，高通量測序技術的結果相比于高通量基因芯片結果，定量的可信程度更高，靈敏度更強，可以作為基因表達豐度的定量方法。因而，本研究基于TCGA數據庫的大樣本生物信息測序數據，篩選HCC差異表達基因列表，并通過差異表達基因的聚類分析，富集代謝相關的信號通路，篩選最有顯著價值的共同代謝重編程相關基因。我們下載TCGA數據庫內現存所有的374例HCC相關樣本的詳實數據，其中腫瘤與癌旁配對的50對標本納入差異表達基因分析。由于總體低表達基因（low read counts）通常不是差異分析的目的基因，對研究結果意義不大；因此，我們只將每個基因平均raw read counts＞1 者納入分析。并設置最終差異表達分子納入標準為：FDR＜0.05，log CPM＞1且|FC|＞3。在篩選過程中，既往文獻報道一般將差異表達的標準設定為|FC|＞1.25～2.00，P＜0.05，對表達量log CPM沒有要求。本研究中設定的差異表達標準篩選出的差異表達分子在標本中既達到一定的表達量，又同時保證了腫瘤組織與癌旁組織表達值之間具有統計學差異，結果的可信度更強，也更加具有臨床意義。為了更加精確篩選和全面評估參與HCC代謝重編程的基因，減少應用單一通路富集分析方法存在偏倚的可能性，本研究采用GSEA、GO和KEGG共3種通路富集方法，最終我們篩選了26個代謝重編程相關基因。

ACLY是26 個代謝重編程相關基因之一，是脂質代謝通路上游的關鍵酶[14]，在腫瘤細胞的脂肪酸從頭合成中發揮著重要作用，催化內源性脂質從頭合成的第一步反應，即線粒體來源的輔酶A和檸檬酸經其催化轉變為草酰乙酸及乙酰CoA。在腫瘤的代謝重編程中，脂肪酸合成代謝具有特殊重要的作用[15]。脂肪酸來源可分為外源性吸收和內源性從頭合成，大多數正常細胞通過外源性途徑獲取，然而在腫瘤細胞中超過90%的脂肪酸來源于內源性從頭合成[16]。脂肪酸從頭合成速率增加可顯著促進細胞膜物質的生物合成。脂肪酸合成增加，尤其是從頭合成增加，是惡性腫瘤細胞的重要特征之一[17-18]。抑制腫瘤細胞的內源性脂肪酸合成，可誘導腫瘤的退化[19]。ACLY在癌細胞中常見上調表達，在多種腫瘤中，ACLY的活化和表達能夠促進腫瘤生長，比如膀胱癌、結直腸癌、膠質母細胞瘤、肺癌等[20-23]。在結直腸癌中，ACLY的過表達可以誘導伊利替康的耐藥，但敲減ACLY可以逆轉該結果[20]。在許多永生化細胞系中，ACLY異常上調表達也普遍存在[24]。此外，通過抑制ACLY可以阻斷MAPK和PI3K/Akt通路，從而抑制癌細胞的生長和增殖[25]。但在HCC中ACLY表達水平尚未見報道。我們的臨床標本檢測結果和來源于GEO的數據均表明ACLY在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，與其他癌癥類型類似。

為了進一步明確ACLY過表達在HCC預后中的意義，我們納入GEO數據進行臨床相關性研究。分析結果表明：ACLY的異常表達與TNM分期、CLIP分期、AFP相關（P＜0.05）；ACLY的異常高表達與HCC患者總生存率相關（P=0.023），而且與無復發生存率存在相關性的趨勢（P=0.052）。總體生存單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析表明，僅ACLY的表達水平與總體生存顯著相關（P=0.041）。無復發生存單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析表明：僅ACLY表達水平與患者術后無復發生存顯著相關（P=0.008）。ACLY表達水平與患者預后生存時間具有顯著的相關性，可以作為HCC生存預后的一個獨立風險預測指標，其效能可能優于常見的臨床病理指標。

總體而言，ACLY的表達上調是HCC患者預后的獨立危險因素。代謝重編程相關基因的功能相對明確，可作為腫瘤靶向治療的靶點，逆轉代謝重編程過程，進而有助于控制HCC的進展，這可能是今后HCC的有效治療策略。