手機成像在生物活性物質實驗教學中的應用

謝旭婷，Cheong Kit-Leong

（汕頭大學理學院生物系，廣東 汕頭515063）

目前實驗教學依然在高校所開設課程中占極大比重，其對提高學生的動手實操能力以及實踐創新能力都有著舉足輕重的作用。在傳統的生物活性物質實踐課教學過程中，受器材、專業實驗員數量、學生人數等因素限制，往往多為驗證性實驗或模擬實操，不能保證每位學生的參與。為了培養學生的實踐能力與創新能力，提高實驗教學效果，在保留原有的生物活性物質實驗課程的基礎上，對實際操作進行了一定創新，以求在達到教學目的的同時激發學生的創造性，提高其學習熱情。

近年來隨著對生物活性物質的研究與開發利用的深入，對天然來源的低聚糖的研究也越來越受到關注。低聚糖是一種低分子量、低聚合度的糖類化合物，由2～20個單糖通過糖苷鍵連接而形成直鏈或支鏈，因其多樣的生物活性如抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤和免疫調節等受到業界廣泛關注。而由于結構與功能之間存在的緊密聯系，對低聚糖的結構分析也成為當前研究熱點。但目前對低聚糖混合物的分離和性質研究仍是糖類研究中的難點之一，其主要原因是糖分子因缺乏生色基團或熒光基團，使其直接檢測困難，并且由于低聚糖的化學組成類似，存在多種異構體，且具有不同的連接方式和分支形式，其結構異常復雜多樣，因此分離難度很大。常用的低聚糖結構分析方法包括高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、質譜（MS）、核磁（NMR）以及薄層色譜（TLC）和熒光輔助糖電泳（FACF）等。其中HPLC具有重現性好、分辨率高等優點，常用于糖類的定量分析，但其樣品前處理過程比較繁瑣；GC一般要求樣品具備一定的揮發性和熱穩定性；NMR在確定低聚糖化學結構上具有高特異性、高靈敏度、結果信息豐富等優點。但這些方法需要昂貴的儀器和專業技術人員，并且它們在應用上具有一定的局限性；而采用TLC法雖然操作簡單，但分辨率低且不能將結構相似的糖組分分開；相比而言，FACE則是一種簡單、快速、靈敏的糖類分析方法，其可同時對多個中性和酸性低聚糖樣品進行分析，因此較適用于低聚糖的分離。

FACE操作簡單且不需要昂貴儀器以及專業技術人員，學生均可參與實驗，是一種比較適用于本科教學實驗的方法。傳統FACE實驗中使用凝膠成像分析系統對低聚糖電泳條帶進行拍照，而因各實驗室凝膠成像分析儀數量有限，學生往往需排隊輪流使用或分小組派代表進行操作。為了達到使每位學生在既定課堂時間內均參與實驗的目的，我們在傳統的FACE實驗基礎上，利用智能手機空間成像系統在紫外暗箱中對電泳所成低聚糖分離條帶進行拍照，并與傳統實驗中使用凝膠成像分析系統所獲取的圖片進行分析對比，以期在提高教學質量的同時獲得更快速簡便的低聚糖糖譜分析技術。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

昆布二糖、三糖、四糖、五糖標準品，Solarbio公司；瓊膠二、四、六、八、十、十二糖標準品，Solarbio公司。

氨基-1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS）；氰基硼氫化鈉（NaBHCN）；二甲亞砜（DMSO）；丙烯酰胺；雙丙烯酰胺；過硫酸銨（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；鹽酸（HCl）；乙酸；尿素；甘氨酸；氫氧化鈉，以上試劑均為分析純，用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器

電泳儀；華為智能手機；蘋果智能手機；凝膠成像分析系統；天平；氮吹儀；冰箱。

1.3 實驗方法

（1）溶液配制

配制0.1 mol/L ANTS溶液，1 mol/L NaBHCN溶液，6 mol/L尿素，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，10%AP，pH 8.8 Gly-Tris電泳緩沖液，含37%丙烯酰胺與3%雙丙烯酰胺的分離膠與濃縮膠母液，棕色瓶4℃保存。

（2）ANTS衍生化

取聚合度分別為2、3、4、5的昆布寡糖標準品各5 mg分別溶解于1 mL 50%的乙醇水溶液中，配制昆布寡糖原始樣液，從各樣液中各取60μL混合得昆布寡糖標準品母液。將母液氮氣吹干或凍干，加入20μL 00.1 mol/L ANTS溶液和20 L 1mol/L NaCNBH溶液，混勻后置37℃水浴衍生化16 h。然后于35℃將糖樣品吹干，加300μL 6 mol/L尿素重懸得昆布寡糖樣品溶液，-20℃冰箱保存備用。

同上，取聚合度分別為2、4、6、8、10、12的瓊膠寡糖標準品各5 mg溶解衍生得瓊膠寡糖樣品溶液，-20℃冰箱保存備用。

（3）制膠

將玻璃板清洗干凈，待用。根據ZHANG等電泳方法稍作修改，按表1分別配制分離膠和濃縮膠，先配制好分離膠后立即緩緩注入制膠槽，緩慢加入1 mL水壓實，待分離膠完全凝固后把水吸出，注入濃縮膠，并在上方放置合適梳子以形成加樣孔。濃縮膠凝固后輕輕拔出梳子，將凝膠連同膠槽板一起放入裝有適量緩沖液的電泳槽內待用。

表1 分離膠和濃縮膠的配制Tab.1 Preparation of separation glue and concentrated glue

（4）加樣

使用移液器分別吸取10μL稀釋64、32、24、16、8、4、2倍的昆布寡糖樣品溶液，緩慢加至浸沒電泳緩沖液的加樣孔內。

使用移液器分別吸取10μL稀釋64、32、24、16、8、4、2倍的瓊膠寡糖樣品溶液，緩慢加至浸沒電泳緩沖液的加樣孔內。

（5）電泳

將電泳槽放在冰水浴中，連接正負極，啟動電源，設置電壓、電流、功率、時間分別為350 V、150 mA、30 W、2 h；電泳結束后在365 nm紫外燈下觀察。用凝膠成像儀、蘋果手機和華為手機分別拍照、保存、分析。流程如圖1所示。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimentalprocess

2 結果與分析

2.1 ANTS與糖衍生化機理

ANTS衍生反應過程同其他胺化還原反應相同，首先還原糖分子在溶液中存在著半縮醛和醛之間的動態平衡。然后標記物ANTS的氨基與糖的還原端（醛基）發生親核反應，消除一分子水，產生席夫堿（Schiff′s base），形成醛與席夫堿之間的動態平衡，最后氰基硼氫化鈉將生成的席夫堿迅速專一地還原成穩定的二級胺。見圖2。

圖2 ANTS與糖衍生化反應機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of derivative reaction mechanism between ANTS and sugar

2.2 寡糖電泳結果

通過衍生化反應，寡糖分子的還原末端結合熒光集團，經聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳進行分離，最終得到的結果經過紫外燈照射后，可以根據電泳條帶的數量及熒光強度判斷出寡糖的成分及其含量，根據電泳結果得到不同數量條帶，代表不同聚合度的寡糖。寡糖與ANTS進行衍生反應，在紫外透射光條件下顯示熒光條帶，每個條帶代表一種寡糖。圖3、圖4為不同成像設備拍照所得的昆布寡糖和瓊膠寡糖凝膠分離譜圖及利用Quantity one與Origin軟件轉換的對應峰圖。

圖3 昆布寡糖標準品電泳條帶與對應峰圖Fig.3 The electrophoretic bands and corresponding peaks of laminaria oligosaccharide standards

圖4 瓊膠寡糖標準品電泳條帶與對應峰圖Fig.4 The electrophoretic bands and corresponding peaks of agar oligosaccharide standards

由圖3可知，不同聚合度的昆布寡糖的分離效果明顯。這是由于聚合度小的糖比聚合度大的糖遷移得快導致的結果。由電泳條帶可以看出，有4種組分得到了有效的分離，根據條帶位置可判斷由上至下分別代表聚合度為5、4、3、2的昆布寡糖。通過對比三種成像方式得出的照片可明顯得出，利用智能手機成像系統拍照得出的電泳條帶圖分辨率更高，凝膠成像儀顯現5條泳道的條帶圖，而智能手機可顯現6條泳道的條帶圖。與之對應的峰圖也進一步證實此結果，且由峰圖可知，智能手機成像系統所得照片各條帶的豐度明顯高于凝膠成像儀所成照片中各條帶豐度。

由圖4可知，不同聚合度的瓊膠寡糖分離效果明顯。由電泳條帶可以看出，有6種組分得到了有效的分離，根據條帶位置可判斷由上至下分別代表聚合度為12、10、8、6、4、2的瓊膠寡糖。同上，對比三種成像方式得出的照片可明顯得出，利用智能手機成像系統拍照得出的電泳條帶圖分辨率更高，凝膠成像儀清晰顯現5條泳道的條帶圖，而智能手機可清晰顯現7條泳道的條帶圖。與之對應的峰圖也進一步證實此結果，并且由峰圖可知，智能手機成像系統所得照片各條帶的豐度明顯高于凝膠成像儀所成照片中各條帶豐度。

3 結論

本實驗中，在寡糖分子中引入熒光基團ANTS后，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳能有效地分離鑒定不同聚合度的寡糖混合物。根據不同聚合度的寡糖分子在電場中的遷移速度不同可迅速分離不同聚合度的寡糖，并由條帶位置判斷各聚合度寡糖。結合電泳條帶與其對應的峰圖可得出，使用智能手機成像系統拍攝的照片比凝膠成像儀所成的照片具有更高的分辨率，且各條帶對應峰的豐度明顯高于凝膠成像系統拍攝的照片。再者，使用智能手機成像系統拍攝電泳結果圖的方法，操作簡單，設備充裕，不需要特別昂貴的儀器和操作熟練的技術人員，在一般實驗室中就可以完成這項工作，因此可作為一種新型實驗方式應用于教學實驗中。

本實驗在傳統基于凝膠成像系統拍攝電泳條帶照片的內容下，采取了一種新型的實驗方式，利用智能手機成像系統對電泳結果進行拍照，使用Quantity One與Origin軟件進行峰圖轉換，得出利用智能手機成像系統可完成電泳結果的拍攝要求，且明顯優于凝膠成像系統所得照片。這一方法可應用于高校生物活性物質實驗課程中的電泳實驗課程，尤其是對糖類物質的分離鑒定，加之目前學生基本人手一部智能手機，因此實驗取材方便，且相較于凝膠成像儀，智能手機更經濟適用且不需專人指導，彌補了高校生物活性物質實驗課程中因實驗設備凝膠成像儀數量不足造成的學生無法全部實操的缺憾。

實驗中采用的新型實驗方式開發了學生的創造性，提高了學生參與課程的積極性，增強了學生對生物活性物質實驗課的興趣。實驗中每位學生都參與并對自己所拍攝的照片進行峰圖轉換與分析，不僅提升了必要的實驗技能，也掌握了結果處理與分析的能力，培養了學生獨立分析和解決問題的能力。同時該方法還能更好地活躍課堂氛圍，有助于學生對知識的記憶，并且對教師提高課堂效果，完成教學目標具有一定助益。