聚己內酯/納米羥基磷灰石靜電紡纖維膜的制備及其生物活性

李友瑞 張子晗 熊世江 宋花蕾

1 濱州醫學院附屬醫院 山東 濱州 256603； 2 山東大學口腔醫院 山東 濟南 250012

外傷、先天發育異常、腫瘤手術切除等可導致嚴重的頜面骨缺損，嚴重影響患者的發音、美觀及功能[1]。目前骨缺損的修復主要采用自體骨移植、異體骨移植以及牽張成骨等技術，但常存在繼發損傷、免疫排斥、塑形性差、成骨能力有限以及技術要求高等問題[2]。近年來，骨組織工程的研究為骨缺損的修復提供了新的方案選擇，支架材料是骨組織工程的三要素之一，是骨組織工程研究的重點。支架材料是由促進細胞粘附的生物活性材料制備而成，應具有多孔的三維結構促進細胞遷移、增殖和分化并有足夠的機械強度。羥基磷灰石是天然骨的主要無機成分，有較高的生物相容性和骨傳導性，被廣泛用作骨組織替代和再生的生物材料[3]，然而納米羥基磷灰石(nanohydroxyapatite, nHA)因機械性能差、易脆等特點限制其應用。有學者嘗試將納米羥基磷灰石與生物聚合物/有機材料結合成復合形式，以克服其機械性能的劣勢。近年來常用的有機材料主要有聚-L-乳酸(PLLA)、聚己內酯(PCL)、聚-L-乙醇酸(PLGA)、聚(羥基丁酸酯-共-戊酸酯)(PHBV)、纖維素和聚乙烯醇(PVA)等高分子材料，其中PCL是一種具有良好生物相容性且可生物降解的無毒聚合物[4]，廣泛用于生物醫學工程和藥物控釋等研究，然而其自身具有弱親水性、骨誘導活性較差等特點。靜電紡技術可將有機聚合物制備成具有三維結構的生物支架，制作簡單，性能穩定。本研究旨在研究聚己內酯/納米羥基磷灰石纖維膜的理化表征及其與MC3T3-E1細胞的相互作用，探討復合纖維膜是否適合應用于骨組織工程。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 聚己內酯(Sigma，美國)；納米羥基磷灰石(麥克林，上海)；羅丹明-鬼筆環肽(Sigma，美國)；反轉錄試劑盒(Roche，美國)；實時熒光定量PCR試劑盒(Roche，美國)；CCK-8檢測試劑(日本同仁)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天，上海)；高壓電源(東文高壓電源，天津)；微量注射泵(康康醫療，安徽)；掃描電子顯微鏡(EVO LS15，Zeiss，德國)；透射電子顯微鏡(HT7700，HITACHI，日本)；接觸角檢測儀(Harke，北京)；熒光實時定量聚合酶鏈反應儀(Corbett, 澳大利亞)；激光共聚焦顯微鏡(TCS SPE，Leica，德國)；萬能力學測量儀(Instron5565，美國)；MC3T3-E1細胞(武漢大學口腔重點實驗室贈送)。

1.2 實驗方法

1.2.1 靜電紡纖維膜的制備 常溫下，2.4 g PCL溶解于5 mL DMF與7.5 mL DCM的混合溶液中，標記為純PCL組。然后按照30%、40%(wt/wt)比例加入納米羥基磷灰石，磁力攪拌至少8 h至完全混合均勻，分別標記為PCL+30%nHA組、PCL+40%nHA組。靜電紡絲制備過程均用同一高壓電源及微量泵，保持環境在適宜的溫度和濕度。具體條件是：高壓電壓為(25±0.5)kV，靜電紡絲溶液流速3 mL/h，接收板到針尖的距離為20 cm。靜電紡絲成膜后，室溫下收集置于真空干燥箱備用。

1.2.2 SEM及TEM檢測 用導電膠將4.5 mm×4.5 mm大小的靜電紡絲膜固定在金屬載物臺，表面噴金后，掃描電鏡觀察復合纖維支架的形態并計算納米纖維的平均直徑。靜電紡絲纖維膜接收到有碳膜的銅網上，室溫干燥備用，然后透射電鏡觀察。

1.2.3 拉伸強度測定 將各組納米纖維剪成5 cm×2 cm條狀，厚度0.5 mm。采用萬能測試機檢測器拉伸強度，測試參數為拉伸速率為10 mm/min、溫度為20℃、相對濕度為50%。

1.2.4 接觸角檢測 纖維膜固定在載玻片上，滴加0.5 mL ddH2O，用顯微鏡頭捕捉液滴在材料表面伸展的圖像，然后用軟件分析接觸角的圖像。

1.2.5 細胞在纖維膜的粘附及形態 接種12 h后，采用羅丹明-鬼筆環肽標記細胞骨架，4′、6-二脒-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 標記細胞核，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在納米支架的伸展及粘附情況。

1.2.6 細胞毒性檢測 MC3T3-E1細胞以2×103/孔的密度接種在96孔板(已放入支架材料)，到預定時間點(1天、4天、7天)，棄原培養液，將10 μL的CCK-8液加入到孔板中，每組5個復孔，37℃孵育4 h。然后吸取上清到另一新96孔板中，利用酶標儀在450 nm下檢測吸光度值(OD)。設置一個空白組(未加細胞及支架材料)，一個對照組(含有細胞，不加支架材料)。

1.2.7 堿性磷酸酶檢測 將MC3T3-E1細胞按照1×105/孔的密度接種于24孔培養板(已放入支架材料)。培養基為含有誘導液的培養基，隔2天換液。誘導7天、14天、21天后，分別取樣檢測405 nm處的吸光度值，以PCL組為陰性對照，每個樣品設三個復孔。

1.2.8 RT-PCR檢測RUNX2基因表達 骨誘導7天、14天、21天時，剪碎接種有細胞的支架，Trizol提取細胞總RNA。采用逆轉試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，采用RT-PCR檢測基因Runx2，引物序列為(5′-3′：CCTTCAAGGTTGTAGCCCTC，3′-5′：GGAGTAGTTCTCATCATTCCCG)。以GAPDH(5′-3′：ACTTTGTCAAGCTCATTTCC，3′-5′：TGCAGCGAACTTTATTGATG)為內參計算2-ΔΔCt值，其中ΔΔCt=(實驗組目的基因Ct值-實驗組內參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值)。每組樣品設置3個復孔。

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0對數據行統計分析，定量數據采用均數±標準差的形式，多組定量資料的t檢驗對數據進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SEM及TEM結果 電鏡下所示(見圖1)，靜電紡絲呈現無序的三維交錯結構，纖維之間交錯成網狀。純PCL纖維支架材料粗細較均勻，纖維表面較光滑。聚己內酯/nHA的支架有一定的團聚，表面略粗糙,其纖維支架直徑略有增粗，但差異無統計學意義。3組靜電紡絲纖維的直徑分別為(550.90±37.43)nm、(617.18±30.17)nm、(630.02±60.53)nm。

A. PCL組；B. 30%nHA組；C. 40%nHA組。右上角為透射電鏡圖像。

2.2 拉伸強度及接觸角結果 PCL組親水性較差，聚己內酯/nHA支架組的親水性明顯提高,接觸角小于90°(見圖2)。PCL組強度最高，隨nHA的增加，聚己內酯/nHA支架組的拉伸強度逐漸降低，均小于PCL組，差別有統計學意義(P<0.05)。40%nHA組拉伸強度最低，均小于其余兩組，差異有統計學意義(P<0.05)；其余各組間無統計學差異(見圖3)。

A. PCL組；B. 30%nHA組；C. 40%nHA組。

與PCL組比較，*P<0.05；與30% nHA組比較，#P<0.05。

2.3 細胞的粘附生長 細胞在纖維膜表面充分伸展，偽足較多(見圖4)。與PCL組相比，聚己內酯/納米羥基磷灰石組(30%nHA組、40%nHA組)細胞粘附生長的數量明顯提高(P<0.05)(見圖5)；聚己內酯/納米羥基磷灰石組可明顯提高細胞在支架表面的生長增殖。

A. PCL組；B. 30%nHA組；C. 40%nHA組。

與PCL組比較，*P<0.05。

2.4 CCK-8和ALP結果 CCK-8檢測結果顯示接種第4、7天時，聚己內酯/納米羥基磷灰石組的OD值高于純聚內酯組(P<0.05)，其余各組間差異無統計學意義(圖6)。

與PCL組比較，*P<0.05。

ALP檢測結果顯示，細胞接種14天、21天時聚己內酯/納米羥基磷灰石組的ALP水平明顯高于純聚己內酯組及空白對照組，P<0.05(圖7)。聚己內酯/納米羥基磷灰石纖維膜可促進ALP的表達。

與空白組和PCL組比較，*P<0.05。

2.5 RT-PCR結果 細胞接種7天、14天時，聚己內酯/納米羥基磷灰石組RUNX2 mRNA的表達明顯高于純PCL組，差異有統計學意義(P<0.05)。細胞接種21天時，聚己內酯/納米羥基磷灰石組RUNX2 mRNA的表達水平顯著低于純PCL組且有統計學差異(P<0.05)，其余組間比較無統計學意義。以上結果說明，RUNX2在MC3T3-E1細胞的成熟分化的早期高表達，在晚期低表達，這種趨勢在聚己內酯/納米羥基磷灰石組較明顯。見表8。

與空白組和PCL組比較，*P<0.05。

3 討論

靜電紡絲技術基本原理是在高壓電場作用下，帶電液體通過電場并拉伸形成一個向收集器噴射的稀薄液體噴射流，該液體多為聚合物溶液，其中溶劑在噴射過程中蒸發，聚合物溶液連續噴射，形成連續交聯的纖維支架結構，其直徑一般在10 nm到10 μm之間[5]。與相分離、泡沫法、凍干法等三維支架的制備技術相比，靜電紡絲制取方法具有易操作、取材方便、參數可控等優點，是制備支架材料常用的方法。已有學者使用靜電紡絲技術將nHA與有機聚合物(PLGA、PVA等)結合形成三維纖維支架而nHA的活性未被破壞[6]。本研究在借鑒其他學者研究的基礎，嘗試將nHA嵌入PCL纖維支架，構建具有骨傳導性纖維支架復合材料。 聚己內酯/納米羥基磷灰石組直徑略有變大，但差異無統計學意義。本實驗采用的羥基磷灰石的直徑較小(300～450 nm)，納米羥基磷灰石在纖維內部的重疊聚集可導致纖維直徑略有增大。透射電鏡結果顯示，聚己內酯/納米羥基磷灰石組有明顯的納米羥基磷灰石重疊影像，纖維表面較粗糙[7]。有學者的研究表明纖維表面粗糙度的增加受纖維直徑增大的影響，這與本研究的結果是一致的[8]。有學者研究指出隨機取向制備nHA嵌入的纖維支架可影響支架材料表面的粗糙度，本研究采用隨機取向制備纖維在一定程度增加了材料表面的粗糙度[9]。聚己內酯/納米羥基磷灰石組的拉伸強度降低，這可能與nHA的加入引起納米纖維連續性降低及單位面積的聚內酯的量減少有關[10]。研究表明，nHA過多可導致靜電紡絲溶液的粘稠度增加，導致相同靜電紡條件下更易出現纖維的斷裂，從而可能導致纖維支架拉伸強度的降低[10]。

親水性是細胞在支架材料表面粘附生長的基礎，純PCL組的纖維疏水性較強，不利于細胞的粘附生長。接觸角的結果顯示，在滴加液體3 min后，聚己內酯/納米羥基磷灰石組接觸角明顯降低小于90°,說明其纖維膜材料潤濕性好，具有良好的親水性。這可能與納米羥基磷灰石具有親水性的羥基，從而導致材料的潤濕性提高[10]。

聚己內酯/納米羥基磷灰石組有利于MC3T3-E1細胞的粘附生長。一方面復合支架材料表面粗糙度較高可促進MC3T3-E1細胞在支架表面的粘附生長，這與其他學者的研究結果是一致的[11]。另一方面，納米羥基磷灰石的加入改善復合支架材料表面的潤濕性，研究表明細胞在親水性的材料表面更容易粘附生長增殖[12]。此外，另一學者研究發現納米羥基磷灰石可與細胞的RGD多肽結合發揮作用進而促進細胞的粘附增殖[11]。

成骨相關基因Runt相關轉錄因子2(RUNX2)的表達可提示MC3T3-E1細胞的增殖成熟分化情況。既往研究表明RUNX2在細胞分化過程中高表達，一旦細胞成熟后其表達水平明顯降低[10]。實驗結果說明聚己內酯/納米羥基磷灰石復合支架材料可明顯地促進MC3T3-E1成骨向的分化、成熟及礦化，且nHA含量越多其促進作用更顯著。

本研究成功制備出富含nHA的復合聚己內酯支架材料，并對其理化表征、生物學性能及成骨性能進行檢測，可見制備的材料支架具有較理想的理化表征，能夠促進細胞的黏附和增殖，說明富含納米羥基磷灰石的靜電紡絲支架是一種具有良好潛能的骨組織工程支架，在后續的研究中將在動物實驗中使用該復合靜電紡絲支架進行骨修復，進一步驗證材料的性能。