生物活性玻璃45S5體外對根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化的影響

崔彩云 董艷梅 邱莞迪 劉玉三 王雯虹 李言君

1 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔內科 山東 濱州 256603；2 北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院牙體牙髓科 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室 北京 10081；3 煙臺萊山口腔醫(yī)院兒童口腔科 山東 煙臺 264003

Sonoyama等[1]從根尖未發(fā)育完全的第三磨牙根尖牙乳頭組織中分離出新的干細胞群，這類細胞具有間充質干細胞的特征和較強的端粒酶活性，被命名為根尖牙乳頭干細胞(stem cell from the apical papilla, SCAP)。同一個體來源的SCAP比牙髓細胞具有更強的繁殖能力、細胞遷移能力和體外組織再生能力[1]；將SCAP與生物材料HA-TCP、HA等復合移植于裸鼠皮下，材料表面有典型的牙本質樣物質沉積[1-3]；此外，動物實驗證實牙根發(fā)育早期摘除牙乳頭但保留完整的牙髓其牙根發(fā)育停止，SCAP被認為是牙根部成牙本質細胞的主要來源[4]。SCAP在具有一定成牙本質方向分化的能力，具有用于牙髓牙本質復合體再生及牙根發(fā)育的潛能。

生物活性玻璃(bioglass，BG)是一類在臨床上應用廣泛的硅鈣磷酸鹽類生物活性材料，其中最具代表性的為Hench教授于1969年研制成功的生物活性玻璃類材料Bioglass(45S5)，研究發(fā)現(xiàn)45S5與骨組織的直接結合，提出了生物活性的概念[5]，BG植入體內后表面迅速礦化生成羥基磷灰石與周圍組織形成組織結合；此外材料降解釋放具有基因激活作用的硅、鈣、磷等離子對細胞成骨、成血管等相關的多種基因表達具有促進作用，其臨床應用產品(MEP?，ERMI?，PerioGlas?，NovaBone?，Biogran?，BonAlive?)現(xiàn)已被廣泛用于骨、牙周等組織的再生領域[6]。近年由于BG其良好的生物活性及組織相容性在牙髓牙本質復合體再生領域的研究逐漸得到關注。BG浸提液促進牙髓細胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化結節(jié)能力以及ALP，牙本質磷酸蛋白(DSPP)，牙本質基質蛋白(DMP-1)的表達增強[7]；BG顆粒能促進牙髓細胞增殖、礦化結節(jié)形成及DMP-1，DSPP表達增強，且異位移植BG能夠誘導含小管樣結構的牙本質形成[8-9]；BG作為蓋髓材料能誘導露髓孔處修復性牙本質橋形成[10-11]。此外，添加生物活性玻璃的復合支架材料通過激活整合素、BMP及MAPK等信號通路對牙髓細胞成牙本質方向分化有顯著促進作用[12-14]。生物活性玻璃具有誘導牙髓細胞成牙本質方向分化的能力，具有用于牙髓牙本質復合體再生的潛能。

牙髓細胞和根尖牙乳頭細胞共同起源于牙乳頭組織，有一定的組織來源相似性；生物活性玻璃能夠誘導牙髓細胞成牙本質方向分化，但生物活性玻璃對根尖牙乳頭細胞成牙本質分化作用并不明確。綜上所述，本研究推測生物活性玻璃能夠促進根尖牙乳頭細胞成牙本質分化，本實驗選用45S5生物活性玻璃，制備其浸提液體外誘導根尖牙乳頭細胞，研究其對根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 高糖型達爾伯克必須基本培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)、青鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-EDTA購自美國Gibco公司；特級胎牛血清購自天津康源公司；I型膠原酶、甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自德國Roche公司；茜素紅購自中國碧云天生物技術有限公司；氯化十六烷基吡啶購自中國北京索萊寶科技有限公司；生物活性玻璃45S5購自中國上海阿拉丁公司。倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會所；Realtime-PCR儀、酶標儀購自美國Thermo lab systems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 根尖牙乳頭細胞的獲得培養(yǎng) 本實驗所使用的根尖牙乳頭組織均取自濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科門診12～18歲的患者，因正畸需求拔除的上頜或下頜第一或第二前磨牙，取樣前均取得患者的知情同意。實驗方案通過濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審查([2017]倫審字(KT-552)號)。拔牙前對待拔牙進行消毒，局麻下拔除牙齒，立即用PBS沖洗3遍，沖洗干凈牙齒表面的血液及雜質，4 h內進行原代培養(yǎng)。用無菌刀片切下牙齒根尖部牙乳頭組織，用眼科剪修剪組織至1 mm ×1 mm ×1 mm 大小，移入15 mL離心管。離心后，棄上清液，沉淀物中加入1 mL I型膠原酶，37℃水浴消化3 h，至組織塊完全消失，加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，培養(yǎng)箱中消化1 min，再加入培養(yǎng)基終止消化。離心后，棄上清液，沉淀物中加入2 mL含20% FBS的原代培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液一次，待細胞融合達到70%～80%后進行細胞傳代，取第4～6代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 45S5浸提培養(yǎng)液和45S5礦化誘導液的配制 將45S5顆粒放于180℃恒溫箱高溫干熱滅菌4 h，冷卻至室溫備用。將45S5按照0.1 mg/mL加入DMEM培養(yǎng)液，37℃浸提24 h，離心后取上清，0.22 μm濾器過濾即45S5浸提液；不加入45S5的DMEM培養(yǎng)液，37℃浸提24 h，離心后取上清，0.22 μm濾器過濾即DMEM浸提液。向上述各浸提液內分別加入10%(體積百分比)FBS，1 %(體積百分比)青霉素-鏈霉素混合液，獲得45S5浸提培養(yǎng)液和DMEM浸提培養(yǎng)液。

分別向DMEM浸提培養(yǎng)液和45S5浸提培養(yǎng)液內依次加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、10 nmol/L地塞米松和50 mg/mL抗壞血酸；混勻后7.4% NaHCO3調節(jié)pH至7.0～7.2，獲得礦化誘導培養(yǎng)液和45S5礦化誘導培養(yǎng)液。

1.2.3 離子釋放情況檢測 45S5浸提培養(yǎng)液和DMEM浸提培養(yǎng)液的制備同1.2.2。取新鮮制備的各組浸提液3 mL，采用離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma analysis，ICP)測試上述各組浸提液中Si、Ca、P離子的濃度(由北京大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生院中心儀器室測定)。

1.2.4 MTT法檢測根尖牙乳頭細胞增殖 按照培養(yǎng)液的不同將細胞分組進行培養(yǎng)，其中加入DMEM浸提培養(yǎng)液為對照組，加入45S5浸提培養(yǎng)為45S5組。取4～6代根尖牙乳頭細胞待細胞生長融合達80%時，PBS溶液輕柔漂洗3次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，離心棄上清。加入DMEM培養(yǎng)液重懸細胞后，按照96孔板每孔加入約5×103個細胞，37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)過夜待細胞貼壁，記為第0天；分別按實驗設計加入DMEM浸提培養(yǎng)液和45S5浸提培養(yǎng)液，37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)液。

誘導培養(yǎng)的第1、3、5、7和9天分別吸去待測孔的培養(yǎng)液，加入180 μL含2%(體積百分比)FBS的DMEM培養(yǎng)液、20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，將細胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，緩慢吸凈培養(yǎng)孔內液體，每孔加入150 μL DMSO，于37°C恒溫振蕩器上100 r/min振蕩10 min至板底結晶物充分溶解。設定酶標儀490 nm波長處讀取吸收值，測定各孔光密度值(Optical Density，OD值)，記錄結果。以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5 Realtime-PCR檢測根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化相關基因的表達 按照培養(yǎng)液的不同將細胞分組進行培養(yǎng)，其中加入DMEM浸提培養(yǎng)液為對照組，加入45S5浸提培養(yǎng)為45S5組。按5×103個/cm2密度將細胞接種于6孔板中，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)至細胞生長融合達80%時，記為第0天；分別按實驗設計各組分別加入對應細胞生長培養(yǎng)液，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，以后每兩天更換一次細胞生長培養(yǎng)液。共培養(yǎng)7 d后Realtime-PCR檢測成牙本質方向分化相關基因的表達，以GAPDH作為內參，引物序列情況詳見表1。

表1 Realtime-PCR待測基因的引物序列

根據FastStart Universal Sybr Green Master試劑說明書進行Realtime-PCR反應。冰上配置PCR反應液，八連管每個孔中加入10 μL Sybr Green Mix 、0.5 μL PCR Forward Primer(10 μM)、0.5 μL PCR Reverse Primer(10 μM)、0.5 μL cDNA模板、8.5 μL DEPC水；上機ABI 7300 PCR系統(tǒng)兩步法進行RT-PCR反應。反應條件如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min(1個循環(huán)，預變性)；95℃ 15 s，60℃ 60 s(40個循環(huán)，PCR反應)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s(溶解階段)。GAPDH作為內參，用定量的2-△△CT法計算相對mRNA水平。實驗組別為橫坐標、RNA含量為縱坐標繪制直方圖。

1.2.6 茜素紅染色檢測根尖牙乳頭細胞礦化結節(jié)形成 按照培養(yǎng)液的不同將細胞分組進行培養(yǎng)，其中加入DMEM浸提培養(yǎng)液為對照組，即陰性對照組；加入礦化誘導培養(yǎng)液為OM組，即陽性對照組；加入45S5礦化誘導培養(yǎng)液為45S5組。按5×103個/cm2密度將細胞接種于6孔板中，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)至細胞生長融合達80%時，記為第0天；分別按實驗設計各組分別加入對應細胞生長培養(yǎng)液，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，以后每兩天更換一次細胞生長培養(yǎng)液。觀察有鈣結節(jié)形成后，共培養(yǎng)第14和21天進行體外礦化檢測。

在室溫下，吸凈待測孔中的培養(yǎng)液，PBS溶液輕柔漂洗3次；4%(質量百分比)多聚甲醛固定細胞30 min，超純水輕柔漂洗3次，每次2 min；加入等量0.1%(質量百分比)的茜素紅染液染色30 min，去離子水輕柔漂洗3次，每次5 min，去除非特異性染色；觀察、拍照。將茜素紅染色后的孔板徹底晾干，加入1 mL 100 mmol/L氯化十六烷基吡啶溶液，室溫下100 r/min輕搖30 min，至徹底溶解孔板底的染色，孔內液體呈紫色。各孔分別吸取150 μL紫色溶液轉移入96孔板內，將96孔板置于酶標儀562 nm波長處讀取吸收值，測定各孔OD值，記錄結果。組別為橫坐標、OD值為縱坐標繪制直方圖。

2 結果

2.1 根尖牙乳頭細胞培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，如圖1所示，采用酶消化組織塊法培養(yǎng)根尖牙乳頭組織約4 d后，倒置顯微鏡下觀察可見根尖牙乳頭細胞從組織塊中爬出(圖1 A)，細胞呈成纖維樣細胞典型長梭形結構；細胞傳代培養(yǎng)至第四代后細胞形態(tài)典型、生長狀況良好(圖1 B)。

圖1 根尖牙乳頭細胞原代培養(yǎng)及傳代

2.2 離子濃度 ICP檢測，0.1 mg/mL 45S5在DMEM中浸提24 h后，溶液內Si、Ca、P離子濃度如表2所示，45S5顯著升高浸提液中Si離子濃度(P<0.05)，浸提液中Ca、P離子濃度差異無統(tǒng)計學意義。

表2 45S5浸提液Si、Ca、P離子濃度/mmol·L-1

2.3 45S5對根尖牙乳頭細胞增殖的作用 MTT檢測45S5浸提培養(yǎng)液連續(xù)誘導培養(yǎng)人根尖牙乳頭細胞9 d后細胞增殖的情況，如圖2 所示：隨著細胞培養(yǎng)時間的增加各實驗組牙髓細胞的均呈增長趨勢；從誘導培養(yǎng)3天開始45S5組OD值高于對照組OD值，并且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。45S5浸提培養(yǎng)液促進人根尖牙乳頭細胞的增殖。

和對照組比較，*P<0.05。45S5為45S5 生物活性玻璃。

2.3 45S5對根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化的作用 Realtime-PCR檢測45S5浸提培養(yǎng)液連續(xù)誘導培養(yǎng)人根尖牙乳頭細胞7 d后細胞成牙本質方向分化相關基因DSPP、DMP-1的表達情況(圖3)。DSPP基因表達量45S5組高于對照組，(P<0.05，圖3A)；DMP-1基因表達量，45S5組高于對照組，(P<0.05，圖3B)。

和對照組比較，*P<0.05。45S5為45S5 生物活性玻璃。

2.4 45S5對根尖牙乳頭細胞礦化的作用 45S5礦化誘導培養(yǎng)液連續(xù)誘導培養(yǎng)人根尖牙乳頭細胞14和21 d，茜素紅染色后觀察45S5組和OM組均見明顯紅染礦化結節(jié)，但對照組未見明顯紅染礦化結節(jié)(圖4)。

圖4 茜素紅礦化結節(jié)染色

氯化十六烷基吡啶鈣結節(jié)半定量分析各組根尖牙乳頭細胞礦化結節(jié)形成情況：誘導培養(yǎng)14和21 d，OM組、45S5組OD值均高于對照組(P<0.05)，且45S5組OD值高于OM組(P<0.05)(圖5)。

和對照組比較，*P<0.05；45S5組和OM 組比較，#P<0.05。OM為成骨定向培養(yǎng)基組；45S5為45S5 生物活性玻璃。

3 討論

本研究采用生物活性玻璃45S5浸提液誘導根尖牙乳頭細胞驗證45S5體外對根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化的作用，45S5體外顯著促進根尖牙乳頭細胞的增殖、成牙本質方向分化相關基因DSPP、DMP-1表達和礦化結節(jié)形成。本研究證實生物活性玻璃45S5體外促進人根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化。牙髓細胞和根尖牙乳頭細胞共同起源于牙乳頭組織，有一定的組織來源相似性，雖尚無文獻報道生物活性玻璃對根尖牙乳頭細胞成牙本質分化的作用，但大量研究證實生物活性玻璃體外促進人牙髓細胞成牙本質方向分化[8-14]。

DSPP和DMP-1在早期成牙本質細胞分化和礦化牙本質的后期成熟中起重要作用。DSPP和DMP-1基因是牙髓細胞成牙本質方向分化的特異性標志物[15-17]。茜素紅染色礦化結節(jié)是鑒定牙髓細胞成牙本質方向分化的晚期指標[18-19]。本研究中45S5浸提液對根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化相關基因DSPP和DMP-1表達有促進作用，對體外礦化結節(jié)形成有促進作用。生物活性玻璃與體液接觸能夠溶解釋放硅、鈣、磷等離子，是生物活性玻璃具有生物活性的重要原因[6]。ICP測定45S5誘導培養(yǎng)液中硅離子的濃度濃度約為0.5 mmol/L高于對照組，鈣和磷離子濃度與對照組無明顯統(tǒng)計學差異。45S5溶解釋放的離子促進根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化，分泌離子的濃度是影響根尖牙乳頭細胞成牙本質方向分化基因表達的重要因素。

硅是人體組織和器官的必需元素，對DNA的合成、骨形成和代謝發(fā)揮重要的作用。成骨細胞起源于間充質的骨祖細胞，對骨組織的生長發(fā)育、骨代謝平衡、骨量平衡和骨損傷修復起關鍵作用[20]。0.5～4 mmol/L濃度范圍內文獻報道硅離子體外能夠促進成骨細胞的增殖和成骨方向分化。1 mmol/L離子硅溶液處理小鼠MC3T3-E1成骨細胞24 h后顯著促進細胞明顯增殖，促進細胞表達p-NF-κB，抑制細胞表達i-κBα，離子硅可通過激活NF-κB信號傳導通路誘導成骨細胞增殖[21]。不添加礦化誘導劑(β-磷酸甘油磷酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸)的生物活性玻璃45S5誘導培養(yǎng)液(0.5和0.7 mmol/L)促進人胎兒成骨細胞礦化結節(jié)的形成和成骨細胞分化相關基因核心結合因子(Cbfa1)、ALP、I型膠原蛋白、骨粘連蛋白(OSN)、骨涎蛋白(BSP)、骨鈣素(OSX)高表達[22]。硅酸二鈣離子溶出液(0.075 mmol/L)促進人MG63細胞礦化結節(jié)形成和核心轉錄因子(Runx2)、ALP、骨鈣素(osteocalcin，OC)、BMP-2及其信號傳遞蛋白Smad-1的表達，硅酸二鈣離子溶出液中高濃度硅可能通過刺激BMP-2及其信號傳遞蛋白Smad-1表達從而促進 MG63 細胞向成骨細胞分化[23]。4 mmol/L硅離子體外促進人MG63細胞增殖、礦化結節(jié)形成和I型膠原、ERK基因和蛋白的表達，4 mmol/L硅離子體外通過ERK信號通路促進MG63細胞成骨細胞分化；6 mmol/L硅離子由于高滲透壓導致細胞凋亡[24]。硅離子通過激活NF-κB、BMP和MAPK等相關信號通路促進細胞成骨方向分化。

硅酸鹽復合材料中硅離子濃度增加促進牙髓細胞的成牙本質方向分化。SiO2成分含量增加促進牙髓細胞的增殖，通過MAPK信號通路的ERK和p38通路促進牙髓細胞的粘附、增殖和成牙本質方向分化[25]。納米58S BG著促進牙髓細胞ALP活性，成牙本質方向相關基因ALP、COL I、DSPP、DMP-1表達和礦化結節(jié)的形成，納米58S BG體外能明顯促進牙髓必報成牙本質方向分化與納米58S BG在較短時間內釋放更高濃度的硅離子和鈣離子有關[7]。不同硅濃度(1、2、4 mmol/L)硅酸鈣骨水泥提取物呈劑量依賴性的促進牙髓細胞增殖、ALP表達、OC、DSP、DMP-1基因和蛋白的表達，硅酸鈣骨水通過增加p38和ERK活性，促進牙髓細胞成牙本質方向分化[26]。4 mmol/L及以下濃度硅離子體外能夠促進成骨細胞和牙髓細胞的增殖和成骨/成牙本質方向分化，本研究中0.5 mmol/L硅離子體外促進根尖牙乳頭細胞的增殖和分化，具體硅離子的有效作用濃度范圍還需要進一步研究。

綜上所述，生物活性玻璃45S5通過溶解釋放硅離子等促進根尖牙乳頭細胞的增殖、成牙本質方向分化和礦化，但是作用機制仍未明確需要深入研究。生物活性玻璃有望用于臨床上牙髓病和根尖周病的治療。