飛秒激光輔助的兔眼角膜基質透鏡移植觀察

郭 靜 張浩潤 王 銳 趙靜靜 付夢軍

1 濱州醫學院 山東 煙臺 264003； 2 濰坊眼科醫院 山東 濰坊 261000

已有很多學者對角膜基質透鏡移植進行了多方面的探索和研究[1-2]，從冰凍狀態下儀器打磨的同種異體角膜透鏡、角膜基質環植入，到水凝膠材料的人工角膜透鏡植入等，但因制作程序復雜及材料的穩定性差等因素，使得透鏡移植臨床的應用很少。近年來，飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術(femtosecond small incision lenticule extraction，SMILE)的廣泛開展為角膜基質透鏡植入手術的開展提供了有利條件。將SMILE手術中取出的角膜基質透鏡進行保存和再利用，充分發揮了角膜組織的潛在利用價值，不但可以增加角膜的厚度，還可以起到加固角膜生物力學的作用。應用角膜基質透鏡治療的常見疾病有：遠視、角膜淺層病變、感染性角膜病引起的角膜厚度變薄或穿孔，圓錐角膜和角膜膨隆等[3-5]。但目前角膜基質透鏡移植后在角膜厚度和屈光度的矯正方面變化仍存在不確定性因素，本研究應用飛秒激光輔助行兔眼的角膜基質透鏡移植觀察3個月，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6只新西蘭大白兔，購自青島人和順實驗動物繁育有限公司，體質量為2～2.5 kg，月齡為4～5月。所有的動物均遵循《ARVO眼科和視覺研究中動物的使用聲明》的準則，本研究得到了濰坊眼科醫院動物倫理委員會的支持。

1.2 手術方法 術前給予兔子耳緣靜脈注射丙泊酚麻醉(3 mg/kg，起效后10 min追加初始量的1/3)后置于VisuMax全飛秒激光手術床上(Carl Zeiss Meditec，Jena，Germany)。所有兔子均采用“S”號負壓錐鏡，選擇快速掃描模式：激光頻率為500 kHz，點間距為4.5 μm，線間距2.0 μm，能量設置為135 nj。每只兔子均用飛秒激光行左眼SMILE手術，角膜帽厚度為120 μm，角膜帽直徑為7.5 mm，透鏡直徑為6.5 mm，輸入矯正的屈光度為-5.00 D，透鏡基底下加厚度為10 μm，透鏡中央厚度為87 μm，邊切角為90°，邊切口長度為2 mm。激光掃描完成后，去除負壓吸引，分離角膜邊切口，依次分離透鏡前、后表面，最后將透鏡從邊切口取出，隨即放入無菌平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)中備用。每只兔子右眼均應用飛秒激光FLAP程序制作角膜基質囊袋，角膜瓣厚度為120 μm，角膜瓣直徑為7.8 mm，邊切角度為90°，角膜蒂的位置為0°，角膜蒂的角度為300°。激光掃描完成后，分離角膜瓣，將浸泡在無菌BBS液里的透鏡平鋪于囊袋中，調整居中位，復位角膜瓣，配戴角膜繃帶鏡，手術結束。所有手術均由同一位技術熟練的醫生完成。

1.3 術后處理和觀察 所有兔子術畢行裂隙燈顯微鏡檢查，無異常后滴1滴妥布霉素地塞米松滴眼液(典必舒，美國Alcon公司)。術后第1天起滴左氧氟沙星滴眼液(可樂必妥，日本參天制藥)4次/天，用藥1周；氯替潑諾混懸滴眼液(露達舒，Bausch & Lomb Incorporated)4次/天，每周減量1次，用藥1個月。

所有的兔子在術前、術后1天、術后1周、術后1月、術后2個月、術后3個月行裂隙燈顯微鏡檢查、電腦驗光、眼前段照相 (Topcon,Tokyo，Japan)、Pentacam(Oculus Optikger?te GmbH，Wetzlar，Germany)、前節OCT(AS-OCT，Visante，Carl Zeiss Meditec AG，Jena，Germany)和角膜共焦激光顯微(Heidelberg Engineering GmbH，Heidelberg，Germany)檢查。電腦驗光、Pentacam的每次測量均由同一技術人員重復測量3次以上，中央角膜厚度、等效球鏡、平均角膜曲率均取其多次測量的平均值作為每次測量的結果。術后3個月檢查完畢后，采用空氣栓塞法(50 mL空氣耳緣靜脈注射)處死兔子，隨即行眼球摘除術，分離兔角膜，用40 g/L多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，行光學顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 術后一般情況 術后1天角膜上皮可見干燥斑，角膜輕度水腫，透鏡居中，透鏡輪廓清晰，無皺褶及移位。術后1周基質水腫較前減輕，角膜上皮光滑，透鏡居中。術后1月水腫完全消退，角膜透明，透鏡平復在位。術后2、3月復診，角膜透明，角膜基質透鏡植入輪廓欠清(圖1)。

A、B見角膜透明；C、D見術后1天角膜上皮可見干燥斑，角膜輕度水腫，透鏡居中，透鏡輪廓清晰，無皺褶及移位；E、F見術后1周角膜基質水腫較前減輕，角膜上皮光滑，透鏡居中；G、H見術后1月水腫完全消退，角膜透明，透鏡平復在位；I、J為術后2個月，K、L為術后3個月，均見角膜透明，角膜基質透鏡植入輪廓欠清。

2.2 中央角膜厚度 透鏡植入術前中央角膜厚度為(357.17±12.97)μm，術后1周、1月、3月分別為(433.67±12.19)μm、(423.50±13.49)μm、(417.33±12.08)μm，較術前分別增加了(76.50±16.22)μm、(66.33±4.08)μm、(60.17±11.07)μm。整體比較術前術后，P<0.001，術后1周、1月、3月分別于術前相比差異均具有統計學意義(均為P<0.05)，術后各時間點兩兩對比差異均不具有統計學意義(表1)。

表1 透鏡植入手術前后各時間點CCT、等效球鏡、角膜前后表面Km值變化

2.3 等效球鏡和平均角膜曲率 等效球鏡的計算公式為球鏡度加上柱鏡度的1/2。術前等效球鏡為(0.57±1.13)D，術后1周、1月、3月的等效球鏡分別為(-1.98±1.18)D、(-2.65±0.47)D、(-1.84±0.68)D，術后1周、術后1月、2月、3月分別與術前相比球鏡的差值為(-2.52±1.35)D、(-3.22±1.31)D、(-2.42±0.69)D。整體比較術前術后，差異有統計學意義(P<0.001)，術后1周、1月、3月分別與術前相比差異均具有統計學意義(均為P<0.05)，術后各時間點兩兩相比差異均無統計學意義(表1)。

Km為角膜地形圖上的平均角膜曲率。術前前表面Km為(47.80±1.02)D，術后1周、1月、3月分別(53.85±0.99)D、(52.67±1.32)D、(52.53±0.96)D，術后1周、1月、3月分別與術前相比前表面Km增加了(6.05±1.09)D、(4.87±1.69)D、(4.73±1.00)D，術前術后整體比較差異具有統計學意義(P<0.001)，術后各時間點兩兩相比差異均無統計學意義(圖2，表1)。

術前后表面Km為(-6.18±0.15)D，術后1周、1月、3月分別為(-5.78±0.19)D、(-5.73±0.20)D、(-5.50±0.14)D，術后1周、1月、3月分別與術前相比后表面Km的差值為(0.40±0.11)D、(0.45±0.14)D、(0.68±0.15)D，術前術后整體比較差異具有統計學意義(P<0.001)，術后各時間點兩兩相比差異均不具有統計學意義(圖2，表1)。

A、B、C、D分別為術前、透鏡植入術后1周、術后1月和術后3月的兔眼的角膜地形圖。

2.4 眼前節OCT檢查 術后1天，角膜基質水腫，可以清晰觀察到透鏡的前后界面。透鏡植入術后1周、1月角膜水腫較前減輕，仍可以觀察到透鏡的前后界面和透鏡的邊緣。透鏡植入術后2月和3月，角膜透明，可隱約觀察到透鏡的后界面(圖3，圖中紅色箭頭所示部位)。

A.術前眼前節OCT圖像；B. 術后1天圖像，見角膜基質輕度水腫，可以清晰觀察到透鏡的前后界面；C、D分別為術后1周、1月圖像，見角膜水腫較前減輕，仍可以觀察到透鏡的前后界面和透鏡邊緣；E、F分別為術后2月、3月圖像，見角膜透明，隱約觀察到透鏡的后界面。

2.5 角膜共焦激光顯微鏡檢查 透鏡植入術后1周透鏡界面可見高反光顆粒，大小不一；術后1月角膜細胞形態異常，細小神經纖維開始長入；術后2月角膜細胞形態接近正常，神經纖維可見粗大分支；術后3月角膜細胞形態、數量基本正常，神經纖維可見細小分支(圖4)。

A. 術前兔眼的角膜共焦激光顯微鏡下的圖像，見角膜細胞形態規則，神經纖維排列整齊；B. 透鏡植入術后1周角膜圖像，見透鏡界面高反光顆粒，大小不一；C. 術后1月角膜圖像，見角膜細胞形態異常，細小神經纖維開始長入；D. 術后2月角膜圖像，見角膜細胞形態接近正常，神經纖維可見粗大分支；E. 術后3月角膜圖像，見角膜細胞形態、數量基本正常，可見細小神經纖維分支。

2.6 HE染色 術后3個月，HE染色見角膜結構完整，移植的透鏡在位，可觀察到透鏡的前后界面，纖維排列整齊，平行分布，結構清晰，與周邊組織融合未見縫隙(圖5)。

A. 可觀察到透鏡的前后界面，結構清晰，與周邊組織融合未見縫隙(×40)；B. 透鏡移植的界面可見正常角膜細胞，形態規則(×400)。

3 討論

角膜基質透鏡移植可以從組織結構和功能上對角膜基質進行重建，可同時解決角膜基質病變和改善屈光狀態。SMILE手術的開展為角膜基質透鏡植入手術的開展提供了條件。飛秒激光可精準地進行角膜透鏡切削，使取出的透鏡的大小和厚度都是均勻一致的。由于角膜的基質囊袋內無血管及淋巴組織，且囊袋內為無菌環境，不接觸淚液及房水，因此，透鏡植入術后位置居中，術后短期內就可以水腫消退，角膜透明，且發生角膜移植片排斥及角膜感染的概率微乎其微，使得基質透鏡移植可以有效的開展[6-7]。

飛秒激光輔助的角膜基質透鏡移植術，因角膜基質透鏡和基質囊袋均由飛秒激光來完成，精確度高，無需縫合，極大降低了由縫線引起的醫源性的散光和縫線誘導的排斥反應，手術感染的風險小，組織損傷小，術后恢復快。已經有前期的研究證明全飛秒角膜透鏡植入的安全性、穩定性及有效性[8-12]。Ganesh[11]等的研究中應用透鏡移植治療遠視和無晶體眼，角膜基質植入透鏡輪廓清晰，無皺褶、透鏡溶解及移位，取得滿意的臨床效果。Pradhan[10]等將從高度近視患者術眼中取出的角膜基質透鏡植入到另一遠視患者的角膜基質囊袋內，由于角膜前、后表面的變化及角膜的重塑，屈光度僅為矯正的屈光度的一半。因受到臨床病例數量和疾病種類的限制，透鏡移植可以矯正的屈光度目前尚沒有非常可靠的參考標準。在兔眼的透鏡移植手術中，-3.00 D透鏡植入組，兔眼的屈光度由(3.40±0.63)D變化為(-4.10±2.67)D，-6.00 D透鏡植入組中，兔眼的屈光度由(1.20±1.00)D變化為(-9.80±1.44) D，-8.00 D透鏡植入組中，兔眼的屈光度由(1.85±0.68)D變化為(-10.60±1.85)D[13]。在我們的研究中，我們植入的透鏡的屈光度為-5.00 D，術后3月時，矯正的屈光度為(-2.42±0.69)D，角膜前表面Km的變化量為(4.73±1.00)D，角膜后表面Km的變化量為(0.68±0.15)D。本研究認為，透鏡移植對屈光度的改變需要有兩個方面的關注，一是角膜前、后表面曲率的變化，二是角膜上皮厚度的重塑，就像遠視術后的回退和圓錐角膜的發生是一個相似的病理變化過程。

以往矯正遠視的辦法有很多，例如鞏膜延伸術、角膜周邊切開術、自動板層角膜熱成形術等，由于這些手術方式對眼睛的損傷大，預測性差，治療效果不穩定等缺點，被臨床淘汰，直到出現了PRK及LASIK術，應用準分子激光在角膜上皮下磨鑲角膜的周邊部，使得中央角膜曲率變陡，中央角膜屈光度增加來達到治療遠視的目的。由于被動的行成角膜中央的高曲率，其準確性和穩定性也會有一定程度的下降，存在一定程度的回退現象[14-15]。遠視的治療一般限制在6.00 D內，遠視術后角膜中央曲率應控制在46.5 D內，否則造成醫院性的角膜膨隆[9]。在本研究中，應用飛秒激光在角膜表面制作一個囊袋，將同體角膜基質透鏡從一眼取出，植入到另一眼的角膜基質囊袋中，一方面增加角膜中央厚度，另一方面改變角膜中央曲率，增加了角膜中央的屈光度，起到了治療遠視的效果。周躍華等[9]應用角膜透鏡植入治療遠視，97.3%的患者好于或等于術前最佳矯正視力，且裸眼視力大幅度提高的同時，患者的近視力也得到了很好的改善，屈光度1個月就達到穩定狀態。張晶[8]用全飛秒激光基質透鏡治療中高度遠視1年的觀察，術后裸眼遠視力、裸眼近視力、最佳矯正視力較前有明顯提高，術后3月至1年，未見明顯的遠視屈光度的回退現象，說明透鏡移植術后屈光度穩定。也有學者應用透鏡移植治療遠視眼，在1年的隨訪中，證明了他的安全性、有效性和穩定性[4,16]。透鏡移植矯正遠視的原理是增加了角膜的厚度，主動增加了角膜中央的屈光力，改變了角膜的曲率，回退的概率小，臨床效果好。但透鏡植入手術不是簡單的透鏡的疊加，涉及物理學和生物學效應等相關的變化，還需要更多的研究，更大的樣本量的實驗數據觀察。

角膜基質透鏡移植在老花、圓錐角膜及LASIK術后角膜膨隆的治療中有較好的安全性和有效性[17]。在透鏡移植聯合角膜交聯治療圓錐角膜3年的隨訪中，角膜厚度增加，角膜穩定，CDVA顯著提升[18]。有學者應用透鏡移植聯合PTK治療角膜營養不良，用于角膜表層透鏡術，在短期的隨訪觀察中安全有效[3]。兔子的透鏡移植實驗中顯示透鏡移植后角膜厚度顯著增加，其中-3.00 D透鏡移植組角膜厚度從(353±22)μm增加到(397±29)μm，-6.00 D組角膜厚度從(375±16)μm增加到(457±38)μm，-8.00 D組角膜厚度從(367±17)μm增加到(464±27)μm[13]透鏡移植術后2個月，將兔眼角膜石蠟切片后觀察見-3.00和-6.00植入組，透鏡的前后表面已經不清晰，-8.00 D植入組透鏡的邊緣依然清晰。本研究認為移植術后角膜的修復與透鏡的厚度有關。角膜基質透鏡移植后移植的透鏡可與受體角膜組織融合，透鏡移植術后的角膜厚度小于單純疊加的厚度。共焦激光纖維鏡觀察見透鏡移植術后，透鏡的前后表面可見高反光信號，考慮與手術碎屑和膠原反應有關系[13]。透鏡移植術后早期可見透鏡周圍組織水腫，細胞活躍。透鏡移植術后第10天仍有水腫。術后1月,水腫消退，活化細胞逐漸形成靜息，觀察神經纖維再生[19]。3個月時，透鏡體與受體角膜融合，細胞外基質逐漸清除可見較厚的神經纖維。透鏡植入3年的結果顯示其臨床的有效性和穩定性。在本研究中，透鏡移植術后3個月，角膜透明，前節OCT隱約觀察到透鏡的后界面，共焦激光顯微鏡見角膜細胞形態、數量基本正常，可見細小神經纖維分支。

可見透鏡移植有非常多的潛在價值，因角膜基質透鏡組織來源于活體，來源豐富，可改善目前角膜材料短缺及其他手術引起的并發癥等問題。應用飛秒激光在角膜表面制作一個角膜小切口，未形成角膜瓣，對角膜生物力學影響較小，且神經損傷少，能有效的避免術后干眼的發生。但角膜基質內透鏡植入術作為一種新的手術方式，仍存在一些問題和不足之處，需要更長時間和更多樣本的觀察研究。