SDBS殘留對微生物修復石油污染土壤的影響

張秀霞，熊 鑫，郭 鵬，劉炳琨，陳 杰，任文海，孫 娟

(1.中國石油大學(華東) 環境與安全工程系，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206；3.中國石化 江蘇油田分公司 石油工程技術研究院，江蘇 揚州 225009)

石油工業的快速發展為人類社會的進步做出了卓越貢獻[1]。然而，在原油的開采、運輸、加工及使用等過程中，由于操作欠妥、技術不完善等原因致使大量原油進入土壤，導致土壤生態環境惡化，引發一系列環境問題，并嚴重危害人類健康[2]，造成不同程度的生態影響。根據環境保護部和國土資源部已公布的《全國土壤污染狀況調查公報》，中國土壤總超標率高達16.1%[3]，有機類污染物，特別是石油污染物已成為造成土壤安全問題的主要因素之一。

石油污染土壤的修復技術眾多，但各有特點。傳統的修復技術有物理處理技術、化學處理技術和生物處理技術[4-5]。考慮到物理處理技術成本較高、化學法易造成二次污染以及生物處理技術周期較長等問題[6]，在實際操作時，為取長補短，提高修復效果，避免單一操作方法的局限性，經常采用多種方法聯合的修復方式[7]。菌糠炭、秸稈與微生物協同修復石油污染土壤可以提高修復效率[8-10]，漆酶活性、腐殖酸等對石油污染土壤特性和生物修復效果均有促進作用[11-12]，表面活性劑復配強化微生物修復水土體系中的菲[13]，表面活性劑具有顯著降低溶液表面張力的特性[14]，對吸附在土壤中的石油烴具有良好的卷縮和增溶作用，常用作化學淋洗劑。化學淋洗協同微生物處理技術可以有效提高石油污染土壤修復效率、減少環境危害[15]，在石油污染土壤處理中具有廣泛的應用。雖然表面活性劑溶液可以有效去除土壤中的石油烴，但是部分表面活性劑分子會與土壤產生吸附反應，殘留在土壤中，造成二次污染，具有潛在的生態危害[16-17]，甚至有可能會影響后續的微生物修復過程。那么殘留的表面活性劑對生物修復的影響作用如何？殘留多少可以促進修復或抑制修復過程？針對以上問題，筆者通過實驗室模擬修復方法，研究不同十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)濃度下，修復體系石油烴降解率變化及動力學行為，為表面活性劑聯合生物修復提供了基礎參數，對推動表面活性劑在環境修復領域的發展以及表面活性劑淋洗協同微生物修復技術在石油污染土壤修復領域的應用具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

實驗試劑：十二烷基苯磺酸鈉、無水硫酸鈉、硫酸、無水乙醇、鹽酸、硫酸亞鐵(七水)、鉬酸銨、牛肉浸膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、可溶性淀粉、硫酸鎂(七水)、石油醚(餾程規格60～90 ℃)，AR，上海泰坦科技股份有限公司產品；百里香酚藍、亞甲基藍、磷酸氫二鉀、鄰啡羅啉、甲基紅、溴甲酚綠，AR，西隴科學股份有限公司產品。

所用菌種為筆者所在課題組前期篩選并留存的高效石油烴降解菌WH(Ochrobactrumclonep3)。

1.2 供試土樣

取未污染土樣去除雜物后過20目篩，以1 kg土壤中加入50 g原油的比例添加溶解于石油醚的勝利原油，攪拌均勻后置于通風櫥中，定期翻土，自然老化30 d后，作為實驗用土樣。根據土樣理化性質的測定結果，添加一定量NaNO3和KH2PO4溶液，將土樣含水質量分數調整為18%左右，C、N、P質量分數比調整為100∶10∶1[18]。調理后土壤樣品的理化性質見表1。

表1 土樣理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of the soil sample

1.3 固定化微生物的制備

以滅菌后秸稈材料為載體，以WH為高效降解菌，兩者按照1∶5的體積比均勻混合，并在30 ℃下，以160 r/min轉速恒溫培養24 h，使得WH菌得以充分附著在秸稈載體上。隨后倒掉上層培養基，用滅菌處理后的0.9%(質量分數)NaCl溶液將附著WH菌的秸稈載體移出。在離心機中以1000 r/min轉速低速離心10 min，棄去上清液，繼續加入0.9%NaCl溶液，以相同條件離心2次，得到附著WH菌的秸稈載體，即為秸稈固定化微生物[19]。

1.4 土壤理化性質的測定及調整

土壤pH值，含水率，石油烴含量，C、N、P質量分數比等是石油污染土壤微生物修復過程中的關鍵影響因子。根據土壤基本理化性質測定結果，將上述關鍵影響因子調整到最適合WH菌修復石油污染土壤狀態。修復過程中土壤pH值、含水率、C含量、N含量、P含量、石油烴含量分別采用電位法、重量法、重鉻酸鉀容重法-稀釋熱法、凱氏定氮法和堿熔-鉬銻鈧分光光度法、超聲萃取-紫外分光光度法測定[20]。

1.5 微生物修復殘留表面活性劑的石油污染土壤方案

設定13組微生物法修復表面活性劑殘留石油污染土壤實驗方案，每組模擬修復實驗用土為500 g。根據1.3節的實驗結果，1 mL WH游離菌菌液所含細菌數量為9.49×1010CFU(菌落總數的單位)，1 g秸稈固定化微生物吸附細菌數量為1.19×1012CFU。進行等生物量換算可知，1 g秸稈固定化微生物吸附的細菌數量相當于12.56 mL游離菌菌液含有的細菌數量。依據上述結果，設置模擬修復實驗方案見表2。每隔7 d測定各模擬修復組土壤石油烴含量，計算石油烴降解率。

表2 模擬微生物修復石油污染土壤實驗方案Table 2 Design of simulated microbial remediation of the petroleum-contaminated soil

1.6 石油烴降解率的計算

土壤石油烴降解率按公式(1)計算。

(1)

式中：ηi為第id石油烴降解率，%；w0為土壤初始石油烴質量分數，g/kg土壤；wi為第i天土壤石油烴質量分數，g/kg土壤。

2 結果與討論

2.1 SDBS對WH菌降解石油烴效果的影響

為了研究SDBS對石油烴降解率的影響，首先在液相石油溶液中加入質量分數為10%的高效降解菌群WH，再分別加入不同濃度SDBS溶液，降解7 d，測定溶液的石油烴含量，考察SDBS對高效石油烴降解菌WH降解石油烴效果影響，結果見圖1。

由圖1可知，當表面活性劑SDBS質量濃度小于10 mg/L時，會抑制液體培養基中WH高效石油烴降解菌降解石油烴的行為，隨著液體培養基中SDBS濃度的增加，WH菌降解石油烴效果逐步得到改善。當液體培養基中SDBS質量濃度達到100 mg/L時，WH菌降解石油烴效果最好，超過不添加SDBS的實驗對照組的降解效果，說明SDBS對WH菌產生了明顯的促進作用；繼續增加SDBS質量濃度超過100 mg/L，WH菌降解石油烴的效果反而下降。這可能是因為，在較低濃度時SDBS不僅未能有效分散團聚的石油烴，而且對WH菌產生一定的毒害作用，干擾甚至抑制其生理活動，導致其降解石油烴能力降低；隨著SDBS質量濃度的增加，石油烴分散情況得到改善，增加了WH菌與待降解石油烴接觸的可能性，故石油烴降解效果得到改善；繼續增加SDBS質量濃度，雖然可以有效增溶石油烴，但是較高濃度的SDBS對WH菌生理活動的抑制作用占據主導地位，將不利于石油烴的降解。由液相的實驗結果可以看出，適當濃度質量SDBS的加入有利于石油烴的降解，下文將對SDBS在各種修復方式下修復石油污染土壤的影響進行考察。

圖1 SDBS質量濃度對WH菌石油烴降解率的影響Fig.1 Effects of SDBS mass concentration on petroleum hydrocarbon degradation rate by WH bacteria w(WH)=10%;t=7 d;There are 0.2 g oil in 100 mL liquid medium.

2.2 模擬修復過程中土壤石油烴含量變化

供試土樣初始含油質量分數為46.70 g/kg土壤，對供試土樣進行42 d的微生物模擬修復實驗，每隔7 d測定各修復組石油烴含量，計算各個修復周期的石油烴降解率，考察SDBS對各種修復方式修復效果的影響。

2.2.1 SDBS添加量對土著菌+秸稈修復石油污染土壤的影響

在石油污染土壤中，依據其中的土著菌，添加適量的秸稈作為結構調理劑，考察SDBS添加量(質量分數，下同)對石油烴降解率的影響，結果見圖2。

圖2 SDBS添加量對土著菌+秸稈修復石油污染土壤過程中石油烴降解率的影響Fig.2 Effects of SDBS dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate during microbial remediation (indigenous bacteria with straw) m(Straw)=0.5474 g;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖2和表2可知，在模擬修復的前28 d，4種修復體系石油烴降解率均隨時間增加而逐漸增大，28 d后微生物降解土壤石油烴效率均明顯放緩，土壤中石油烴含量略有降低并趨于穩定。當修復體系SDBS添加量為225 mg/500 g土壤(TJ1)時，會明顯促進土壤石油烴的降解，42 d的石油烴降解率為22.34%，比對照組(TJCK)的20.15%增加了2.19百分點。然而，當修復體系SDBS添加量為500 mg/500 g土壤(TJ2)時，反而會抑制土壤石油烴降解，石油烴降解率比對照組降低了2.11百分點，為18.04%。當SDBS添加量為1925 mg/500 g土壤(TJ3)時，會顯著抑制土壤石油烴降解，42 d的石油烴降解率為10.16%，比對照組降低了9.99百分點。因此可以得出，如果前期用SDBS處理石油污染的土壤，且其殘留量較大時，會對土著菌+秸稈調理的微生物修復方式產生比較大的抑制作用。

2.2.2 SDBS添加量對土著菌+秸稈固定化微生物修復石油污染土壤的影響

在石油污染土壤中，添加適量的秸稈固定化微生物，考察SDBS添加量對石油烴降解率的影響，結果見圖3。

圖3 SDBS添加量對土著菌+秸稈固定化微生物修復石油污染土壤過程中石油烴降解率的影響Fig.3 Effects of SDBS dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate during the microbial remediation (indigenous bacteria with straw immobilized microorganisms) m(Straw microorganisms)=3.9874 g;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖3和表2可知，在模擬修復過程的前28 d，所考察4種修復體系的石油烴降解率均隨時間增加而逐漸增大，28 d后微生物降解土壤石油烴效率明顯放緩，土壤中石油烴含量略有降低并趨于穩定。在體系中添加秸稈固定化微生物后，當SDBS添加量為225 mg/500 g土壤(TG1)和500 mg/500 g土壤(TG2)時，均會促進土壤石油烴的降解，42 d的石油烴降解率分別52.14%和53.45%，比對照組(TGCK)的50.02%分別增加了2.12和3.43百分點，且后者促進效果略優于前者。然而，當修復體系SDBS添加量為1925 mg/500 g土壤(TG3)時，則會明顯抑制土壤石油烴降解，42 d的石油烴降解率僅為18.01%，比對照組降低了32.01百分點。

2.2.3 SDBS添加量對土著菌+游離菌微生物+秸稈修復石油污染土壤的影響

在石油污染土壤中，依據其中的土著菌，并添加適量的秸稈+游離菌微生物，考察SDBS添加量對石油烴降解率的影響，結果見圖4。

圖4 SDBS添加量對土著菌+游離菌微生物+秸稈修復石油污染土壤過程中石油烴降解率的影響Fig.4 Effects of SDBS dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate during the microbial remediation (indigenous bacteria with straw as well as free microorganisms) V(WH bacterium)=50 mL;m(Straw)=3.9874 g;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖4和表2可知，在模擬修復過程的前28 d，考察的4種修復體系石油烴降解率均隨時間增加而逐漸增大，28 d后微生物降解土壤石油烴的效率明顯放緩，土壤石油烴含量略有降低并趨于穩定。在體系中添加秸稈后，當SDBS添加量為225 mg/500 g土壤(TYJ1)和500 mg/500 g土壤(TYJ2)時，均會促進土壤石油烴的降解，42 d的石油烴降解率分別為49.87%和51.22%，比對照組(TYJCK)的48.11%增加了1.76和3.11百分點，并且后者促進效果略優于前者。然而，當修復體系SDBS添加量為1925 mg/500 g土壤(TYJ3)時，則會明顯抑制土壤石油烴降解，42 d的石油烴降解率17.88%，比對照組降低了30.23百分點。

綜上可以看出，表面活性劑SDBS對不同修復體系的作用是不同的，以下將考察相同濃度的SDBS對不同體系的影響。

2.2.4 SDBS質量分數1 mg/g時對不同體系石油污染土壤修復效果的影響

SDBS的質量分數為1 mg/g(即500 g石油污染土壤中加入500 mg的SDBS)時，考察其對不同體系石油污染土壤修復效果的影響，結果見圖5。

圖5 1 mg/g SDBS對不同修復體系的石油烴降解率的影響Fig.5 Effects on petroleum hydrocarbon degradation rate in different remediation systems with 1 mg/g SDBS m(SDBS)=500 mg;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖5可知，在42 d的模擬修復過程中，土壤中石油烴的降解率分別為：土著菌+秸稈固定化微生物(TG2)53.45%，土著菌+游離菌WH+秸稈(TYJ2)51.22%，土著菌+秸稈(TJ2)18.04%，土著菌(CK)5.02%。土著菌+秸稈固定化微生物(TG2)的修復效果最好。圖5結果說明：在石油污染土壤修復的過程中既要補充石油烴降解菌還要添加結構調理劑秸稈，以增加土壤體系的孔隙率和氧的傳遞效率；適當表面活性劑的殘留對石油烴的降解具有一定的促進作用；秸稈固定化微生物的修復效果優于秸稈+游離微生物WH菌的組合，這再一次證明了固定化微生物在土壤修復中的重要作用[21-22]。

從上述的實驗結果可以看到，不同的修復方式，不但修復的效果不同，修復速率也不同。不論對哪一種修復方式，石油烴降解率增長幅度最大的都在21 d，21 d過后，降解率的增長率放緩，另外，土著微生物+秸稈固定化微生物和土著微生物+游離微生物+秸稈2種修復方式前28 d的石油烴降解率的增長率都比較高，說明修復的啟動速率快，維持的時間較長，最終的修復效果也較好。因此，在石油污染土壤修復過程中，優先采用固定化微生物的修復方式，其次是將游離微生物和固定化的載體材料分別加入，這兩種修復方式條件下，SDBS少量殘留都可以對生物修復起到一定促進作用，且修復啟動快，可達到不錯的修復效果。

3 結 論

土壤中殘留低濃度的SDBS對后續的微生物修復石油污染土壤具有促進作用，高濃度的SDBS反而有抑制作用，SDBS的殘留質量分數要控制在1 mg/g 土壤以內。在有SBDS殘留的石油污染土壤中，土著菌+秸稈固定化微生物的修復效果要明顯優于土著菌+游離WH高效降解菌的修復效果，稍好于土著菌+游離WH高效降解菌+秸稈修復方式。當修復體系中SDBS質量分數為1 mg/g土壤時，土著菌+秸稈固定化微生物的修復效果最好，42 d的石油烴降解率達到53.45%。

固定化微生物修復石油污染土壤的方式可以迅速啟動，且在較長的時間內都具有較高的石油烴降解率增長率，對土壤的適應性和持續修復性能較強。在SDBS存在的條件下，固定化微生物促進石油污染土壤的機制有待進一步研究。