BD FACSAria Ⅲ流式細胞分選儀的常見故障分析

任曉越，李敬賢，熊纓

上海科技大學 生命科學與技術學院，上海 201210

引言

流式細胞分選儀可將具有特定標志物或功能的細胞從混合細胞群中分離出來，再進行細胞培養、蛋白檢測、基因編輯、基因組測序等應用[1-4]。隨著細胞治療和精準醫療的快速發展，流式細胞分選技術將在臨床研究與治療中得到更廣泛的應用[5]。

市場上主流的分選型流式細胞儀有BD公司的FACSAria Ⅲ、Beckman公司的MoFlo XDP、Sony公司的SH800，將各個儀器的特征進行分析對比[6]，詳見表1。其中，BD FACSAria Ⅲ的熒光靈敏度最高，意味著最佳的樣本分辨率。

表1 市場上不同品牌流式細胞分選儀的分析對比

作為市場占有率最高的分選儀之一[7]，BD FACSAriaⅢ可用于進行干細胞、腫瘤細胞、生殖細胞等各類細胞的分選，細胞可以收集到收集管和不同孔徑的孔板中進行后續分析或培養[8]。在儀器使用過程中，會出現側液流分散、無法分選、噴嘴堵塞等各類故障情況，導致分選無法進行。目前，比較熱門的是對流式細胞術實驗方法的開發和優化，而對于儀器在使用中出現的故障情況研究案例較少，且并未探討故障背后的原因。所以，在多年BD FACSAria III使用經驗的基礎上，本文通過BD FACSAria Ⅲ原理簡介及一些維修案例的分享，總結探討維修經驗和方法，以期為同行提供參考。

1 設備原理

流式細胞儀是集現代物理電子技術、激光技術、計算機技術于一體的先進科學技術設備，能夠對處于快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析[9]。流式細胞分選儀在流式細胞分析儀的基礎上增加了分選系統，細胞分選儀BD FACSAria Ⅲ由三個主要部分構成，分別是液流車、流式細胞儀主機和工作站（BD FACSDiva軟件）。液流車能夠向主機供應鞘液、清洗液，并從主機里回收廢液；流式細胞儀主機包括液流組件、光學組件、電子組件[10]；工作站可以控制進樣和流速，并通過攝像頭實時監測細胞分選情況。

在一定壓力下，樣本被進樣針吸取進入石英杯樣品池，鞘液經由另一管線進入，在壓力驅動下包裹著排成單列的細胞經過噴嘴后加速到達檢測點，激光照射到細胞上發生散射和折射，發出散射光，同時，細胞攜帶的熒光素被激光照射發出熒光。檢測器把散射光信號轉換成電信號，熒光則被聚光器收集，經各個光纖傳導進入八角轉盤或三角轉盤檢測器，被不同濾光片組件拆分后，由對應的光電倍增管檢測器接收并將熒光信號轉換成電信號。最后經過數據化的處理，輸入電腦儲存分析[11]。被鞘液包裹的樣本流經過噴嘴后，被振蕩器振蕩成為均勻的液滴，包含有目標細胞的液滴會被充以電荷，在電場的作用下偏轉進入收集器中，其余液滴則會進入廢液槽中。流式細胞分選原理如圖1所示。

圖1 流式細胞分選原理圖

2 常見故障的解決方法

2.1 故障一

2.1.1 故障現象

BD FACSAria Ⅲ不能正常進樣，進樣速度一直顯示為0，或流速固定為1.0時，進樣速度不能穩定，變化較大。正常狀態是：以100 μm噴嘴為例，流速為1.0時，1.5 mL無菌水加1滴時間延遲校準微球的正常進樣速度為1000 evt/s。

2.1.2 故障分析

如果儀器無法正常進樣，通常是由于進樣針被堵塞。需要分為兩種情況進行分析：① 樣品未混勻或未過篩網，有聚集的細胞團塊堵塞了進樣針；② 樣品分選過程中逐漸發生堵塞。另外，還有一種可能即上樣倉沒有卡緊，導致上樣壓力不正常，從而無法正常進樣。

2.1.3 故障解決

根據以上的3種情況，采用不同的方法進行判斷，從而排除故障：① 上樣時間延遲校準微球，觀察上樣顆粒數的情況。如果進樣速度正常，就將樣品卸載下來，用細胞篩網過濾樣品后再上樣；② 仔細觀察進樣速度的變化，當數值快速降低時，就是進樣針快被堵塞，此時應該將樣品卸載下來，多次反沖進樣針；如果堵塞嚴重，把管夾閥里嵌著的白色軟管取出，快速反沖進樣針。如果還是無效，就必須更換主要進樣管線和相連白色軟管（圖2）；③ 通過上樣后能否聽到咔噠聲這一方法判斷上樣倉是否卡緊，解決方法是在樣品架上邊沿位置涂抹潤滑油，以起到密封的效果。

圖2 BD FACSAria III的進樣管線

2.2 故障二

2.2.1 故障現象

液流不穩定，斷點位置不穩定，會上下跳動，且Gap值變化很大。正常狀態：正常開機以后，不同規格噴嘴的液流狀態如圖3所示。

圖3 BD FACSAria III的三種噴嘴所對應最佳液流斷點圖

2.2.2 故障分析

由于鞘液包裹的樣本經過激光器被檢測之后，才會被振蕩成為單個液滴，液流的穩定性決定了從檢測點到加電分選位置的時間差變化[12]。那么對于判斷是否能夠分選到正確的目的細胞，液流穩定性在整個細胞分選的過程就至關重要。

如果液流中有開機清洗后殘余的乙醇或者氣體，那么在液流經過噴嘴被高頻振蕩形成單個液滴過程中，液滴表面張力會發生變化，從而影響液滴形成過程，破壞斷點位置的穩定性。另外一種可能是當噴嘴被堵塞或是樣品池中有碎片時，會阻礙鞘液的液體流動，導致液體的流動性受到影響，進而導致液流不穩定。

2.2.3 故障解決

通常情況下，延長無菌水的清洗管路時間，或者選擇菜單欄cytometer下面的液流啟動用鞘液充滿管路來排除氣體和乙醇，是非常有效方法。如果發現鞘液過濾器中有氣泡，可以擰松鞘液過濾器上的閥門，手動排除過濾器中的氣體。

根據實驗過程中的樣品情況分析，如果分選樣本未及時過濾或是死細胞較多時，那么就會使噴嘴被堵塞或樣品池中有碎片。此時，應立刻關閉液流，拿走噴嘴，超聲噴嘴1 min，如果仍然無效，可以點開stream，用鞘液沖洗樣品池約10 s。

2.3 故障三

2.3.1 故障現象

分選過程中，側液流不集中，較分散（圖4）。

圖4 不同分選狀態的側液流圖

2.3.2 故障分析

在判斷儀器故障狀態之前，首先要確認樣本情況，當樣品細胞太大的時候，細胞在液滴中的比重偏大，說明所用噴嘴對于樣品細胞的規格是不合適的，此時應該更換一個更大規格的噴嘴。

排除樣本因素之后，通常情況，需要考慮的是電場中的加電情況，這需要分為兩種情況進行分析：① 分選倉的電極板上濺了鞘液，影響電場的導電；② 液流圖像窗口的2nd、3rd、4th Drop values不是最優值，影響了中心液流的聚電效應。

除此之外，在觀察液流圖像時進行分析，如果噴嘴有輕微堵塞或者Ampl值不是最優值，也可能造成側液流分散。

2.3.3 解決方案

根據上述分析，首先應打開分選倉檢查電極板上是否有液體，若有，則應關閉液流，用無塵紙擦干凈分選倉內電極板上的液體；其次調節液流圖像窗口的2nd、3rd、4th Drop values這三個值，加強聚電效應，集中側液流。在排除上述兩種情況后，可以通過超聲噴嘴，或者重新調整優化Ampl值來解決這一故障問題。

3 討論

目前，大多數研究均聚焦于細胞分選儀實驗方法的開發和優化，忽略了對儀器故障和維修情況的整理和研究。基于多年來在儀器操作過程中的常見故障現象，本文結合流式細胞術分選原理，詳細列舉了各種情況下故障案例的成因，并結合分析各種解決方案的有效性，以便其他使用者在碰到相同故障時可以對可能的原因進行優先排除，能更快更準的解決問題。

本文中分析的三個故障案例都是常見情況，甚至液流不穩定這種現象，儀器使用的新手可能都不會注意到。但是液流的穩定性和側液流狀態對分選結果的好壞至關重要，即能否分選到正確的細胞。分選儀在臨床上雖不用做診斷設備，但是可能會用于細胞治療中的靶細胞分離純化、或者分離臨床樣本用于后續機理研究，如果得不到足夠純的目的細胞，細胞治療的效果可想而知，后續機理研究的準確性也值得商榷。所以，在實際儀器操作中，一旦出現故障，要及時排除，確保珍貴的臨床樣本不被浪費，并避免后續更大的損失與浪費。

另外，需要注意的是在儀器操作中個人防護也應引起重視，特別是用于臨床樣本分選的儀器。作為電荷式分選儀，BD FACSAria Ⅲ能夠將鞘液包裹的樣本液流振蕩成為單個的液滴，任何一個氣溶膠液滴均可能包含導致感染的某種細胞。因此，儀器操作者應該做好個人防護，穿戴好實驗服、口罩和手套，來防止可能會有的生物安全風險[13-14]。

在保障儀器正常穩定運行的基礎上，后續本團隊將對影響分離細胞活性的相關因素包括樣品前處理、儀器參數設置、收集狀態等，以及個人防護方面進行深入探索。

4 結論

往往一個很小的問題，會導致大的故障，因此，做好儀器的日常維護與保養非常重要。本文就3例故障案例進行了討論分析，其中故障二即液流不穩定，是所有流式細胞分選儀常見故障類型[15]，所以解決方案可供其他品牌儀器參考借鑒。由于分選樣本的制備過程復雜，所用的抗體試劑也較為昂貴，所以在細胞分選過程中，使用者如果發現上述故障現象，應立刻停止分選，并按照本文提供的解決方案進行排查。

BD FACSAria Ⅲ這款儀器能夠滿足快速分選要求，使用率高，但是售價高昂，零配件價格也高，所以儀器的日常維護和管理非常重要。只有保障儀器的運行穩定，才能更加有效和準確地進行分選實驗，也能提高儀器的使用壽命[16]。本文通過對BD FACSAria Ⅲ的工作原理的介紹，以及對儀器使用過程中的常見故障原因及解決方法的詳細分析，希望為儀器的正確使用及故障的快速排除提供參考，使儀器能高效穩定地運行。