小兒止咳糖漿苯甲酸鈉處方添加量及抑菌效力評估*

高 翔，佘 凡，馬鵬飛△，劉 剛

（1. 陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065； 2. 陜西省楊凌示范區藥品檢驗監測評價中心，陜西 楊凌 712100）

小兒止咳糖漿本身不具有充分的抗菌活性，且為多劑量包裝，使用過程中需反復開啟，存在被污染的風險，為保證產品的正常儲存和使用，避免微生物生長與繁殖，根據制劑特性添加了抑菌劑苯甲酸鈉[1－2]。小兒止咳糖漿曾收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第五冊）》《國家中成藥標準匯編中成藥地方標準上升為國家標準部分口腔腫瘤兒科分冊》，苯甲酸鈉的處方添加量為0.5%。最近3 版《中國藥典（一部）》均收載了該制劑的質量標準，其中2020 年版規定，苯甲酸鈉的處方添加量為0.2%[3]，并將2010 年版首次收載的抑菌劑效力檢查法指導原則上升為抑菌劑效力檢查法，要求更高，定位更準確[4]。但該制劑質量標準未制訂苯甲酸鈉具體的質量控制指標，作為藥品的安全性評估，抑菌劑的添加量、抑菌效力是考察的重點，故本研究中對此進行了考察。現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；壓力蒸汽滅菌器（上海華成醫用核子儀器公司）；HFsafe－760S 型生物安全柜（上海精宏實驗設備有限公司）；MJ－250－Ⅲ型霉菌培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；LRH－250F 型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；PR224ZH 型電子天平(美國奧豪斯公司)。

1.2 試藥

苯甲酸鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100433－201702，供含量測定用）；小兒止咳糖漿（樣品A1－A3，華潤三九＜郴州＞制藥有限公司，國藥準字Z43020385，批號分別為1804033N，1905016N，1905015N，規格為每瓶120 mL；樣品B，廣西維威制藥有限公司，國藥準字Z45021858，批號為180102，規格為每瓶120 mL；樣品C，江西遠東藥業股份有限公司，國藥準字Z36020251，批號為B180531，規格為每瓶120 mL；樣品D，湖北諾得勝制藥有限公司，國藥準字Z42020245，批號為181001，規格為每瓶100 mL），包裝均為口服液體藥用聚乙烯瓶；甲醇、乙酸銨均為色譜純；水為純化水。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基，批號分別為1802052，190508，1801152，190702，均購于北京三藥科技開發公司。培養基適用性檢查符合2020 年版《中國藥典》要求。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，魯氏酵母菌[CICC1417]；工作用菌株均為第3 代。魯氏酵母菌來源于上海保藏生物技術中心，其他菌種來源于中國醫學菌種保藏中心。

2 方法與結果

2.1 苯甲酸鈉含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：WoburnStamsilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－0.05 mol／L 乙酸銨（5 ∶95，V／ V）；流速：1 mL／min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃。

2.1.2 溶液制備

取苯甲酸鈉對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成每1 mL 含苯甲酸鈉0.1 mg 的對照品溶液；精密量取樣品2 mL，置50 mL 容量瓶中，加水約40 mL，超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz）處理20 min，取出，放冷，加水定容，搖勻，作為供試品溶液；取缺苯甲酸鈉的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.1.2 項下3 種溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在與苯甲酸鈉對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密吸取苯甲酸鈉對照品溶液（0.106 3 mg／mL）2，4，6，8，10，12 μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣，測定峰面積。以峰面積值（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y ＝3 228 068 X－75 910，r ＝0.999 9 （n ＝6）。結果表明，苯甲酸鈉質量濃度在0.212 6 ～1.275 6 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.1.2 項下對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件重復進樣6 次，測定峰面積。結果的RSD為0.46%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一樣品（批號為1804033N）供試 品溶液，在室溫下分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣，測定峰面積。結果的RSD 為0.19%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批(含量為1804033N)樣品，依法制備供試品溶液，平行制備6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結果平均含量為2.054 mg／mL，RSD 為0.86%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為1804033N）1.0 mL，共9 份，置50 mL 容量瓶中，分別加入對照品溶液14，18，22 mL，平行加入3 份，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝9）

2.1.4 樣品含量測定

取不同批次樣品適量，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果樣品A1，A2，A3，B，C，D 的含量分別為2.05，2.01，1.88，1.90，1.92，1.84 mg／mL，平均1.93 mg／mL。

2.2 抑菌效力測定

2.2.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、魯氏酵母菌的新鮮培養物，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物，加入適量含0.05%（V／ V）聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，洗脫孢子。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2.2 方法適用性試驗

進行抑菌效力檢查前，需對供試品的計數方法進行驗證，以確定該方法在抑菌劑效力檢查時能有效檢測出供試品中所有試驗菌。按2020 年版《中國藥典（四部）》存活菌數測定方法及方法適用性試驗，對細菌數和真菌數采用1 ∶10 的平皿法（直徑9 cm）進行計數。

2.2.3 抑菌效力測定方法

菌液組：無菌條件下，吸取20 mL 無菌0.9%氯化鈉溶液加入無菌玻璃瓶中，平行制備6 份，將與樣品組相同量的目標菌懸液加入其中，梯度稀釋，采用平皿計數法計數，細菌于30 ～35 ℃培養3 ～5 d，真菌于20 ～25 ℃培養5 ～7 d 后，計算樣品中試驗菌菌數（即初始接種菌液濃度），并換算對數（lg）值。詳見表2(表2、表3中“金葡”為金黃色葡萄球菌，“大腸”為大腸埃希菌，“銅綠”為銅綠假單胞菌，“白念”為白色念珠菌，“魯氏”為魯氏酵母菌，“黑曲”為黑曲霉)。

樣品組：小兒止咳糖漿原包裝瓶樣品與菌液充分混勻。無菌條件下留取原包裝瓶中樣品20 mL，按目標菌的個數平行制備6 份，將2.2.1 項下制備的菌懸液各吸取0.2 mL 加入其中，使1 mL 供試品接菌量為105～106cfu，加菌量不超過容器中樣品量的1%，于渦旋振蕩儀振蕩均勻。將制備好的供試液置23 ℃培養箱避光儲存，分別在14 d 和28 d 對供試液中存活的微生物進行計數。

存活菌數測定：分別于第14，28 天將樣品于渦旋振蕩儀振蕩均勻，無菌條件下，量取樣品1 mL，用無菌0.9%氯化鈉溶液梯度稀釋制成1 ∶10，1 ∶102，1 ∶103的系列溶液，測定。培養物置規定溫度、規定時間培養，逐日觀察結果。根據菌落測定結果，計算1 mL 樣品組各間隔時間的試驗菌數量，并換算成lg 值。詳見表2。

表2 小兒止咳糖漿接菌量、含菌量及lg 值Tab.2 Inoculated－pathogen quantity，germ－containing quantity and lg value of Xiaoer Zhike Syrup

口服制劑抑菌效力判斷標準：按種14 d 時，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌數量的lg 值減少不小于3，白色念珠菌、魯氏酵母菌、黑曲霉數量的lg 值減少不小于1。試驗菌增加數量的lg 值不超過0.5 為未增加。

結果判斷：供試液中試驗菌數量減少的lg 值為與前一測定時間點比較（14 d 比初始，28 d 比14 d）。接種試驗菌14 d 時其數量的lg 值下降情況見表3。結果與14 d 時比較，28 d 時各樣品中各類試驗菌數量的lg 值均未增加。

表3 小兒止咳糖漿中第14 天時試驗菌數量的lg 值降低情況Tab.3 The lg value of decrease of test bacteria in Xiaoer Zhike Syrup on the 14th day

3 討論

本研究中參考文獻[5－6]，建立了小兒止咳糖漿中苯甲酸鈉含量測定方法。該方法操作簡便、結果準確、重復性好，可為小兒止咳糖漿中苯甲酸鈉的含量測定提供參考。同時還對制劑中常用抑菌劑山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯進行測定，均未檢出。

4 個廠家、6 批次樣品中的苯甲酸鈉含量由高到低依次為A1＞A2＞C ＞B ＞A3＞D，添加量范圍為1.8 ～2.1 mg／mL，平均1.93 mg／mL，測定結果均在處方添加量的90% ～110%內。表明不同廠家、不同批次的樣品抑菌劑種類、添加量、抑菌效力均符合藥典標準。

糖漿劑系含有原料藥物的濃蔗糖水溶液，蔗糖量應不低于45% （g／mL），小兒止咳糖漿蔗糖量為65% 。2020 年版《中國藥典》規定含高濃度蔗糖的口服制劑抑菌劑效力測定時還應選用魯氏酵母菌為試驗菌株。魯氏酵母菌耐高糖高鹽高滲環境，可耐受60%蔗糖12%氯化鈉，易致藥物腐敗，為糖漿劑常見的污染微生物。若小兒止咳糖漿加入魯氏酵母菌進行抑菌效力試驗，防腐體系的考察將更加科學、全面。

評估抑菌效力須先考察抑菌劑種類和添加量，防止企業因盲目追求抑菌效力，過量添加或聯合添加的問題。企業應制訂嚴格的內控質量標準，增加抑菌劑含量的質量控制方法。在確定抑菌劑種類和添加量的基礎上，進一步考察抑菌體系控制微生物的能力，全面了解抑菌劑的使用情況，否則單純評估抑菌效力意義不大[7－8]。

本試驗中隨著貯存時間的延長，細菌和真菌數量呈下降趨勢；苯甲酸鈉對細菌的抑制作用十分明顯，但對真菌的抑制作用相對較弱，與相關文獻報道一致[9－10]。

抑菌劑添加量“毒性－活性”的平衡，要求最低有效量，避免增加藥品不良反應[11]。2010 年版以前的各版藥典處方中抑菌劑的添加多依據使用經驗和相關文獻，缺乏試驗數據支撐，添加量無驗證依據。小兒止咳糖漿中苯甲酸鈉的處方添加量由0.5%降至0.2%，14 d 時細菌、真菌下降的lg 值均符合規定。

抑菌劑具有一定的毒性，濃度過高會對嬰幼兒產生潛在危害。人體每日的苯甲酸鈉允許攝入量為0 ～5 mg／kg[12]。依據藥品說明書，5 歲（體質量約17 kg）患兒口服小兒止咳糖漿1 次5 ～10 mL，1 d 3 ～4 次，即15 ～40 mL／d，含苯甲酸鈉30 ～80 mg，已接近其允許最大攝入量（85 mg／d）。企業需進一步優化處方工藝，在保障抑菌效力的前提下，探討更合理的添加量。

小兒止咳糖漿中含有大量的糖類物質，適合真菌生長。空氣中的酵母菌、霉菌可致糖漿發酵、霉變、酸敗及產生渾濁變質。建議企業開發單劑量包裝，減少使用過程中的污染風險，進而減少抑菌劑的添加量，進一步提高藥品的安全性。

處方中甘草流浸膏、桔梗流浸膏、橙皮酊均為乙醇浸出物，有輔助抑菌作用，故抑菌效力和抑菌劑添加量不完全呈正相關，樣品A1并未顯示比樣品D 更好的抑菌效力。抑菌劑發揮抑菌效力，還需結合藥物活性成分、pH、包裝容器（如吸附作用）、輔料等因素進一步考察[13]，但本研究中未做進一步探討，有待后續試驗開展研究。