骨康寧洗劑皮膚刺激性和過敏性實驗研究*

張曉萌，王康俊，陳國彪，王巨才

（海南省藥品檢驗所·海南省藥物質量研究重點實驗室，海南 海口 570216）

膝骨關節炎（KOA）為嚴重影響中老年患者生活質量的慢性退行性疾病，屬中醫“痹證”范疇，中醫藥在臨床治療KOA 中發揮了重要作用。骨康寧洗劑主要由紅花、防風、當歸、羌活、血竭組方，主要功效為活血止痛、通絡除濕，可用于治療膝骨關節功能障礙、風寒濕痹引起的關節炎等。為保證骨康寧洗劑臨床用藥的安全、有效、可控，根據國家藥品監督管理局《證候類中藥新藥臨床研究技術指導原則》及原國家食品藥品監督管理局藥品評審中心《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的指導原則》《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光變態反應）研究的技術指導原則》等文件，通過動物實驗，對骨康寧洗劑的皮膚刺激性和過敏性進行了系統研究，為其臨床應用提供參考[1]?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：CP225D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；UW8200S 型電子天平（日本Shimadzu 公司）；RTZ－10A－RT 型嬰兒秤（無錫市衡器廠有限公司）。

試藥：骨康寧洗劑（駐馬店骨科醫院自制，批號為20191101）；2，4－二硝基氯代苯（上海試劑一廠，批號為89－09－01）；丙 酮（洛 陽 市 化 學 試 劑 廠，批 號 為130304）；水為娃哈哈純凈水。

動物：健康成年日本大耳家兔8 只，普通級，體質量2.0 ～3.0 kg，雌雄各半，購自華蘭生物疫苗有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（豫）2020－0003，合格證號為NO.1109662011000098。健康Hartely 白色豚鼠，普通級，體質量250 ～350 g，雌雄不拘（雌性無孕或未曾產仔），購自陜西省實驗動物質量監督檢測中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（豫）2017－001，合格證號為NO.61003200000425。動物實驗室符合國家相關規定，實驗期間家兔單籠飼養，豚鼠雌雄分籠飼養、每籠5 只，環境溫度（23±2）℃，相對濕度50% ～65%，光照明暗交替各12 h，動物自由飲水、攝食，通風良好，適應性喂養3 d 后進行實驗。本實驗經我所實驗動物倫理委員會審核通過，符合《實驗動物福利倫理審查指南》要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 皮膚刺激性實驗

分組：取家兔8 只，隨機分為完整皮膚組和破損皮膚組，每組4 只，雌雄各半。實驗前24 h，用理發器對家兔背部（脊柱兩側）進行剃毛，再用6%硫化鈉溶液進行脫毛，去毛范圍左、右各10 cm×10 cm。破損皮膚組在用藥部位用無菌8 號針頭劃“井”字，以滲血為度制備破損皮膚。給藥前檢查去毛皮膚的完整性，有損傷者不得納入完整皮膚組。

給藥：采用同體左右側自身對比法，取紗布7.5 cm×7.5 cm，4 層，浸骨康寧洗劑原液（20 mL，參照人體用法用量），貼于左側已去毛的皮膚上，用塑料薄膜覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶固定；右側皮膚同法貼敷純凈水（20 mL）浸潤紗布，作為空白對照。貼敷6 h 后，除去受試物后用溫水清潔給藥部位，破損皮膚采用無菌操作。每天給藥1 次，連續7 d。

觀察指標：單次給藥時于首次貼敷去除藥物后1，24，48，72 h，多次給藥時于每次去除藥物后1 h，肉眼觀察并記錄貼敷部位是否有紅斑、水腫、色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況，以及發生時間和消退時間。如存在持久性損傷，則延長觀察期限，以評價上述變化的恢復情況和時間（不超過14 d）。對于出現中度及中度以上皮膚刺激性的家兔，在觀察期結束時對給藥局部進行病理組織學檢查。

評分標準：無紅斑、輕度紅斑、中度紅斑、重度紅斑和水腫性紅斑分別計0，1，2，3，4 分；無水腫、輕度水腫、中度水腫、重度水腫、嚴重水腫分別計0，1，2，3，4 分（過敏反應中后2 種水腫均計3 分）。刺激分值＝（紅斑積分＋水腫積分）／動物只數。刺激分值＜0.50 為無刺激性，0.50 ～2.99 為輕度刺激性，3.00 ～5.99 為中度刺激性，6.00 ～8.00 為強度刺激性。

1.2.2 皮膚過敏性實驗

分組：取豚鼠40 只，隨機分為藥物組（20 只）、空白對照組（10 只）和模型組（10 只）。致敏前24 h，用理發器對豚鼠脊柱左側進行剃毛，再用6%硫化鈉溶液脫毛，去毛范圍10 cm×6 cm，激發前24 h 同法對脊柱右側進行脫毛處理。

給藥：致敏，各組分別于第0，7，14 天對左側去毛皮膚給予骨康寧洗劑（20 mL）、純凈水（20 mL）和1% 2，4－二硝基氯代苯丙酮溶液（0.2 mL），將骨康寧洗劑和純凈水分別浸入4 層7.5 cm×7.5 cm 的紗布后貼于左側去毛皮膚上，2，4－二硝基氯代苯丙酮溶液均勻涂于左側去毛皮膚上，均用塑料薄膜覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定，貼敷6 h 后除去受試物，用溫水清潔給藥部位。激發，首次致敏后第28 天，各組豚鼠右側去毛區貼敷受試物，操作同致敏給藥。

觀察指標：激發給藥后24，48 h 觀察豚鼠皮膚紅斑、水腫等過敏反應癥狀并評分，同時密切觀察豚鼠是否有哮喘、站立不穩、休克等嚴重的全身性過敏反應出現。如結果難以判定，1 周后再次激發。

評分標準：基本同皮膚刺激性實驗，但最高分1 分。皮膚過敏反應積分≥1 分的均判為皮膚過敏反應陽性，強度分為弱敏性、輕度致敏、中度致敏、強致敏、極強致敏，對應的過敏反應發生率分別為0 ～8%，9% ～28%，29% ～64%，65% ～80%，81% ～100%。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 皮膚刺激性實驗

單次給藥后，破損皮膚組和完整皮膚組家兔的受試皮膚未見明顯異常。多次給藥后，破損皮膚組2 只家兔受試皮膚出現不規律的輕度紅斑，24 h 后紅斑消失，均未見色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄、水腫現象發生。完整皮膚組家兔的皮膚未見明顯異常。詳見表1。

表1 家兔皮膚刺激性實驗結果（± s，分，n ＝4）Tab.1 Results of skin irritation test in rabbits（± s，point，n ＝4）

表1 家兔皮膚刺激性實驗結果（± s，分，n ＝4）Tab.1 Results of skin irritation test in rabbits（± s，point，n ＝4）

時間點完整皮膚組 破損皮膚組骨康寧洗劑純凈水骨康寧洗劑純凈水單次給藥后 1 h 24 h 48 h 72 h多次給藥后 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 0 0 00 0 00 0 00 0 0 0 00 0 00 0 00 0 000000 0.25±0.5 00 0.25±0.5 0 0 000 000 000 0

外用藥對破損皮膚有輕微的刺激性是普遍現象。本實驗中，破損皮膚組的家兔受試皮膚出現的輕度紅斑無規律性，持續時間短，與自身空白對照比較無明顯差異（P ＞0.05），考慮為建模、活動剮蹭時的刺激引起，非藥物引起的刺激反應。

2.2 皮膚過敏性實驗

激發給藥24 h 和48 h 后，模型組豚鼠皮膚出現重度紅斑、中度水腫，致敏率100%，藥物組和空白對照組豚鼠皮膚未見過敏現象，未出現哮喘、站立不穩、休克等嚴重的全身性過敏反應（P ＜0.05），可判斷骨康寧洗劑無致敏性。詳見表2。

表2 豚鼠激發實驗結果Tab.2 Results of the stimulation test in guinea pigs

3 討論

KOA 主要臨床表現為膝關節疼痛、腫脹、僵硬、功能障礙，嚴重時導致關節畸形甚至喪失功能，影響患者的正常生活和工作[2]。《膝骨關節炎中醫診療指南（2020 年版）》指出，中草藥／成藥外用適用于KOA 的發作期、緩解期、康復期。對治療KOA 的中成藥組方規律進行分析[3]，涉及的289 味中藥用藥頻次排序，當歸（75 次）第1，紅花（53 次）第3，羌活（47 次）第6，防風（45 次）第8；常用藥材組合中，當歸－羌活出現頻率排第3。

骨康寧洗劑組方中，紅花所含紅花黃素屬查耳酮類化合物，可通過抗氧化、抑制一氧化氮產生、調節免疫應答等機制發揮抗炎作用[4]。金曉東等[5－6]的研究結果顯示，紅花能降低兔關節液中前列腺素E2和白細胞介素8的含量，通過抑制上述致炎因子起到抑制關節炎癥的作用。防風含有色原酮、多糖、揮發油、香豆素等化學成分，具有解熱、抗炎、鎮痛等藥理活性[7－8]。當歸所含揮發油藁本內酯具有良好的鎮痛作用，有機酸阿魏酸可抑制血小板聚集、改善血液循環，當歸多糖的活血功效顯著[9]。羌活主要含羌胡醇、異歐前胡素、阿魏酸苯乙醇酯、揮發油等，具有抗炎、鎮痛的藥理作用，與當歸配伍可祛風止痛，與防風配伍可宣通氣血[10]。血竭主要成分為黃酮類、苯丙素類、皂苷類、甾醇類等，具有活血化瘀、消腫止痛功效[11]，被譽為活血化瘀“圣藥”。我國現有的血竭是百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹Dracaeua cochiuchiueusis（Lour.）S.C.Chen. 和海南龍血樹Dracaena cambodiaua Pierre ex Gagnep. 的樹脂提取而成，其基源植物主要分布在我國廣西和海南一帶，劍葉龍血樹所產血竭，又稱國產血竭或廣西血竭，在1991 年被國家批準為一類新藥（藥材），海南龍血樹所產血竭也被收入海南省地方標準[12]。

骨康寧洗劑用于關節功能障礙、跌打損傷、腰肌勞損及風寒濕痹所致關節炎等癥狀的治療，主要通過熏洗、敷貼等方式作用于體表皮膚，故有必要通過建立動物模型進行安全性的初步研究。皮膚刺激性實驗中，破損皮膚組的家兔出現過不規律的輕度紅斑，持續時間短，與自身空白對照比較無明顯差異，考慮為破損皮膚建模、家兔活動剮蹭時的刺激所引起，非藥物引起的刺激反應。皮膚過敏性實驗中，藥物組豚鼠未見局部和全身過敏反應。在所設實驗條件下，骨康寧洗劑未引起明顯的刺激性和致敏性反應，局部用藥安全。