小兒柴胡退熱栓的制備及質(zhì)量標準研究*

王莉博，劉澤干，雷 攀，黃良永，葉 方，黃小鳳，王淑慧，杜士明△

（1. 湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北 十堰 442000； 2. 湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；3. 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室·湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000）

中藥柴胡為傳統(tǒng)解表藥材，是傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根[1]，具有解表退熱、升舉陽氣、疏肝解郁功效，主要用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等[2－3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，柴胡的主要藥效成分有柴胡揮發(fā)油、柴胡皂苷等，有解熱、抗炎、保肝、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。其中，柴胡揮發(fā)油是其解熱作用的主要活性成分，效果確切，作用溫和[4]。近年來以其為主要藥效成分研發(fā)了多種新制劑[5]，其中柴胡注射劑作為中藥西制的代表品種，研制于20 世紀40 年代，用于治療流行性感冒、回歸熱、肺結核發(fā)展期的發(fā)熱等癥狀，但不良事件頻發(fā)[6－7]，國家藥品監(jiān)督管理局于2018 年5 月發(fā)布《關于修訂柴胡注射液說明書的公告》，限制其用于兒童。本課題組在柴胡注射液制備工藝基礎上進行了劑型改造，直腸（栓劑）給藥成為簡便、安全的替代途徑。栓劑為傳統(tǒng)給藥劑型，可有效避免使用注射劑引起的局部疼痛和口服制劑的肝臟首過效應，同時能減少透皮貼劑用藥的個體差異，安全性高，患者依從性好[8－9]，是兒童用藥較理想的劑型。基于此，本課題組采用水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發(fā)油并通過β－環(huán)糊精進行包合，采用熔融法制備小兒柴胡退熱栓，依據(jù)2015 年版《中國藥典（四部）》制劑通則0107 栓劑項下質(zhì)量檢查要求制訂其質(zhì)量標準，為后續(xù)藥效學研究和臨床應用提供理論基礎?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC－MS－TQ8040 型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu 公司）；TU－1901 型紫外－可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；RBY－IV 型融變時限檢查儀（天津天大儀器有限公司）；KPL－10 子彈型栓劑模具（長沙益廣制藥機械有限公司）；DF－101S 型恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司）；YP1002N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；PTHW型電熱套（鄭州市煜城儀器有限公司）。

1.2 試藥

柴胡飲片（湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司，批號為20190301），經(jīng)湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院杜士明教授鑒定為傘形科柴胡屬植物北柴胡Bupleurum chinense DC. 的干燥根；正己烷、正己醛、正庚醛均為色譜純，均購于上海麥克林試劑公司；β－環(huán)糊精（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20180613）；半飽和脂肪酸甘油酯（湖北遠成賽創(chuàng)科技有限公司，批號為20160426）；甲醇（武漢市中天化工有限責任公司，批號為20181009）；藥用級氯化鈉（陜西正一藥用輔料有限公司，批號為20190910）；水為純化水（自制）。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

2.1.1 柴胡揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

取柴胡飲片500 g，加入10%氯化鈉溶液中浸泡，采用水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發(fā)油[10]（保持100 ℃左右，避免暴沸），收集初餾液，重蒸餾，得柴胡揮發(fā)油精提液250 mL，備用。取揮發(fā)油精提液1 mL，用甲醇定容至10 mL，采用紫外分光光度法[11]測定揮發(fā)油精提液的吸光度( A1)，并作為評價指標，以料液比（因素A）、浸泡時間（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，考察影響柴胡揮發(fā)油提取率的主要因素[12]，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化柴胡揮發(fā)油提取工藝。詳見表1 至表3?？梢姡饕蛩貙]發(fā)油提取工藝影響大小順序為A ＞C ＞B，3 個因素對揮發(fā)油提取工藝均有顯著影響。綜合以上試驗結果，確定最佳提取工藝為A1B2C2，即料液比為1 ∶10（g ∶mL），浸泡8 h，提取2.0 h。

2.1.2 柴胡揮發(fā)油包合工藝優(yōu)化

取柴胡揮發(fā)油精提液250 mL（其吸光度記為A2），置具塞錐形瓶中，加入適量β－環(huán)糊精，在恒溫水浴磁力攪拌條件下包合，室溫冷卻后，在2 ～8 ℃條件下靜置12 h，抽濾干燥，即得柴胡揮發(fā)油包合物，將包合物置250 mL 圓底燒瓶中，加100 mL 10%氯化鈉溶液溶解，采用水蒸氣蒸餾法加熱使之微沸，保持1 h，收集30 mL溶液，測定吸光度（A3）。計算揮發(fā)油的包合率[包合率＝A3／（A2×空白回收率）×100% ]。在單因素試驗結果的基礎上選取環(huán)糊精用量（因素A）、包合溫度（因素B）、包合時間（因素C）為考察因素[13]，以包合率為考察指標，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化柴胡揮發(fā)油包合工藝。結果見表1 至3?？梢姡窈鷵]發(fā)油包合率的3 個因素的影響強弱為A ＞B ＞C，因素A、因素B 對揮發(fā)油包合工藝有顯著影響。綜合以上結果，確定最佳包合工藝為A3B3C2，即β－環(huán)糊精用量為60 g，在50 ℃條件下，包合2 h。

表1 柴胡揮發(fā)油提取、包合工藝正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of the orthogonal test for extraction and inclusion process of volatile oil from Bupleurum chinense

表2 柴胡揮發(fā)油提取、包合工藝正交試驗設計與結果（n ＝9）Tab.2 Results and design of the orthogonal test for extraction and inclusion process of volatile oil from Bupleurum chinense（n ＝9）

表3 柴胡揮發(fā)油提取、包合工藝正交試驗方差分析結果Tab.3 Analysis of variance for extraction and inclusion process of volatile oil from Bupleurum chinense by the orthogonal test

2.1.3 小兒柴胡退熱栓制備

取柴胡飲片500 g，加入10 倍量10%氯化鈉溶液中浸泡8.0 h，采用水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發(fā)油（保持約100 ℃，避免暴沸），提取2.0 h，收集初餾液，重蒸餾，得柴胡揮發(fā)油精餾液250 mL。柴胡揮發(fā)油精餾液中加入β－環(huán)糊精50 g，于50 ℃恒溫水浴磁力攪拌條件下包合2 h，冷卻至室溫后，置2 ～8 ℃條件下靜置12 h，抽濾干燥得柴胡揮發(fā)油包合物。取半飽和脂肪酸甘油酯75 g，置燒杯中，于50 ℃水浴中攪拌至熔融，加入柴胡揮發(fā)油包合物，攪拌均勻，保持流體狀，注入栓模中，室溫放置30 min，取栓，即得小兒柴胡退熱栓100 粒（每粒質(zhì)量為1.14 g）。共制5 批，批號分別為202008031，202008032，202008041，202008042，202008043。

2.2 質(zhì)量標準研究[14－15]

2.2.1 質(zhì)量檢查

性狀：在黑色背景、日光條件下觀察，小兒柴胡退熱栓呈乳白色子彈型，色澤均勻、一致，表面光滑、完整、細膩，室溫下成型性較好，無軟化、變形或開裂現(xiàn)象。

鑒別反應：取樣品5 枚，置250 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 10%氯化鈉溶液，采用水蒸氣蒸餾法蒸餾后精餾，取精餾液2 mL，加品紅亞硫酸試液2 滴，搖勻，放置5 min 后，溶液顯玫紅色。

質(zhì)量差異考察：每批次栓劑樣品中隨機取10 粒，精密稱定每粒質(zhì)量，計算總質(zhì)量及平均質(zhì)量，結果見表4。總體平均質(zhì)量為（1.136±0.034）g，符合2015 年版《中國藥典》對栓劑的質(zhì)量差異限度要求。

表4 質(zhì)量差異考察結果（g，n ＝10）Tab.4 Investigation results of quality difference（g，n ＝10）

融變時限考察：每批次栓劑樣品中隨機取3 粒，室溫放置1 h 后，置溫度為（37±0.5）℃融變時限檢測儀中檢測，結果見表5。平均融變時間為（18.2±0.47）min，符合2015 年版《中國藥典》脂溶性基質(zhì)栓劑在30 min內(nèi)全部溶解或軟化的融變時限限度要求。

小時不識月，呼作白玉盤。又疑瑤臺鏡，飛在青云端。仙人垂兩足，桂樹何團團。白兔搗藥成，問言與誰餐？蟾蜍蝕圓影，大明夜已殘。羿昔落九烏，天人清且安。陰精此淪惑，去去不足觀。憂來其如何？凄愴摧心肝。（李白《古朗月行》）

表5 融變時限考察結果（min，n ＝3）Tab.5 Results of time－limited melting（min，n ＝3）

微生物限度：依據(jù)2015 年版《中國藥典》微生物檢測限定方法，采用平皿法檢查小兒柴胡退熱栓微生物限度。結果5 批檢測樣品中均未檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等致病菌，檢查結果符合非無菌產(chǎn)品微生物限度標準規(guī)定。

2.2.2 正己醛及正庚醛含量測定[16－17]

1）試驗條件

氣相色譜條件：色譜柱為SH－Rtx－Wax 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；進樣口溫度為230 ℃；分流比為10 ∶1；流速為1 mL／min。程序升溫，色譜柱初始溫為60 ℃、保持2 min，以20 ℃／min的速率升溫至140 ℃、保持3 min，再以15 ℃／min 的速率升溫至180 ℃、保持4 min，最后以10 ℃／min 的速率升溫至230 ℃、保持4 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度為230 ℃，離子源溫度為230 ℃，離子源電壓為70 eV，進樣量為1.0 μL，質(zhì)量掃描范圍m／ z 為45 ～300，溶劑峰切除時間為3 min，質(zhì)譜檢測起測時間為2.5 min，數(shù)據(jù)采集模式為Q3Scan。

2）溶液制備

分別稱取正己醛、正庚醛對照品適量，精密稱定，置10mL 容量瓶中，加入正己烷，制成含正己醛9.900mg／mL、正庚醛7.840 mg／mL 的混合對照品溶液。分別取3 批（批號為202008041，202008042，202008043）小兒柴胡退熱栓各10 粒，精密稱定，置250 mL 圓底燒瓶中，加入10%氯化鈉溶液100 mL，加熱蒸餾，收集前蒸餾液30 mL，用20 mL 正己烷分2 次萃取，合并萃取液，加入適量無水硫酸鈉去除正己烷溶液中的水分，密封保存，濾過，濾液置50 mL 容量瓶中，加正己烷定容，即得供試品溶液。取10 粒空白栓，置250 mL 圓底燒瓶中，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

3）方法學考察

專屬性試驗：取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，按擬訂試驗條件進樣。結果質(zhì)譜圖中基質(zhì)和雜質(zhì)無干擾，專屬性良好，質(zhì)譜條件符合要求。詳見圖1。

圖1 質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum

線性關系考察：取混合對照品溶液，分別稀釋成含正己醛99.00，49.50，24.75，12.38，6.19 μg／mL 和含正庚醛78.40，39.20，19.60，9.80，4.90 μg／mL 的系列混合對照品溶液，按GC－MS 檢測條件分別進樣1 μL。以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、相對峰面積( Y)為縱坐標進行線性回歸，得正己醛回歸方程 Y1＝56 862 X1＋42 431（r ＝0.998，n ＝5），正庚醛回歸方 程 Y2＝28361X2＋75846（r ＝0.998，n ＝5）。結果表明，正己醛、正庚醛質(zhì)量濃度分別在6.19 ～99.00 μg／mL 和4.90 ～78.40 μg／mL 范圍內(nèi)與相對峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限：取混合對照品溶液，逐級稀釋，按擬訂試驗條件進樣，記錄質(zhì)譜圖。以信噪比（S ／ N）為3 ∶1 和10 ∶1 分別計算檢測限和定量限。結果正己醛和正庚醛的檢測限分別為1.23 μg／mL 和1.51 μg／mL，定量限分別為2.05 μg／mL 和2.51 μg／mL。

精密度試驗：取正己醛和正庚醛質(zhì)量濃度分別為24.75μg／mL 和19.60μg／mL 的混合對照品溶液，按擬訂試驗條件連續(xù)進樣6 次。結果正己醛和正庚醛峰面積的RSD 分別為1.26%，0.78%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取“溶液制備”項下供試品溶液（批號為202008041），按擬訂試驗條件分別于0，2，4，6，8 h 時進樣。結果正己醛和正庚醛峰面積的RSD 分別為2.82%，1.58%（n ＝5），表明供試品溶液8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為202008032）6 份，依法制備正己醛和正庚醛供試品溶液，平行制備6 份，按擬訂試驗條件連續(xù)進樣。結果正己醛和正庚醛峰面積的RSD 分別為1.35%，2.32%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為202008041）5 粒，平行6 份，分別精密加入樣品原有量80%，100%，120%的正己醛、正庚醛對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂試驗條件進樣測定，計算回收率。結果見表6。

表6 加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.6 Results of the recovery test（n ＝9）

4）樣品含量測定

取3 批樣品各10 粒，依法制備供試品溶液，按擬訂試驗條件分別進樣測定。結果見表7。

表7 樣品含量測定結果（mg，n ＝3）Tab.7 Content determination of n－h(huán)exanal and n－h(huán)eptanaldehyde in the sample（mg，n ＝3）

3 討論

3.1 栓劑制備工藝優(yōu)化

柴胡藥材中的揮發(fā)油含量較低，且柴胡揮發(fā)油在室溫條件下易揮發(fā)。預試驗中按2015 年版《中國藥典(四部)》揮發(fā)油測定“甲法”提取揮發(fā)油，并結合有機溶劑萃取方法，均無法得到純揮發(fā)油。陳文露等[10]通過水蒸氣蒸餾法得到揮發(fā)油精餾液，進一步制備柴胡注射液。本試驗中主要參考此工藝以揮發(fā)油精餾液吸光度為指標，優(yōu)選最佳提取工藝條件，并通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)吸光度值較穩(wěn)定，此提取工藝穩(wěn)定可行；β－環(huán)糊精水溶性好，空腔尺寸適中，其包合藥物后可提高有效成分在制備及儲藏過程中的穩(wěn)定性[18－19]，因此本研究中用β－環(huán)糊精對揮發(fā)油精餾液進行包合，以包合率為指標，優(yōu)選最佳包合工藝條件；而栓劑制備過程中，通過對其成型溫度（40，50，60 ℃）及脫模時間（20，30，40 min）進行考察。結果顯示，溫度為50 ℃時栓劑成型性較好，色澤均勻，冷卻30 min 后脫模的栓劑表面光滑、細膩。

3.2 栓劑含量測定指標選擇

試驗前期，工藝優(yōu)化主要采用紫外－可見分光光度法測定柴胡揮發(fā)油吸光度，簡便、易操作，但用于含量測定可能會存在一定誤差。柴胡揮發(fā)油的主要有效成分為正己醛、正庚醛等，正己醛、正庚醛可能是其主要解熱、抗炎有效成分[16－17]，因此選擇這2 種成分為指標，采用GC－MS 法測定其含量。試驗結果表明，制備的栓劑性狀、質(zhì)量差異、融變時限等均符合2015 年版《中國藥典》對栓劑質(zhì)量標準的要求，GC－MS 法測定3 批樣品中正己醛和正庚醛最低平均含量分別為1.015 mg 和1.145 mg，因此設定小兒柴胡退熱栓中正己醛含量不得低于每粒0.081 mg，正庚醛含量不得低于每粒0.092 mg。

3.3 方法評價

本課題在中醫(yī)藥理論的指導下，參考相關文獻，并結合現(xiàn)代研發(fā)技術對小兒柴胡退熱栓的制備及質(zhì)量標準進行研究，保證了本品的制備工藝合理、可行。但制備的小兒柴胡退熱栓與已上市的其他柴胡制劑的生物等效性有待進一步研究。課題組下一步將對其藥效學展開研究，以保證小兒柴胡退熱栓相關研究的完整性。