超高效液相色譜法測(cè)定激素性股骨頭壞死患者血漿中甲潑尼龍質(zhì)量濃度*

張麗藏，張 霞，劉 劍，張志清△，董維沖，范欣欣

（1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000； 2. 河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017）

甲潑尼龍屬中效糖皮質(zhì)激素，大量或長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致股骨頭無(wú)菌性壞死、骨質(zhì)疏松、高血壓、高血糖等不良反應(yīng)[1－2]。糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(又稱激素性股骨頭壞死)。遺傳易感等個(gè)體差異也可能是股骨頭壞死的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，PA－1 基因的4G／5G 基因型發(fā)生股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)高，5G 型風(fēng)險(xiǎn)最低。ABCB1 基因型的3435C 發(fā)生股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)比3535T 高2 ～3 倍[3]。通過(guò)探討基因測(cè)序結(jié)果與患者體內(nèi)甲潑尼龍血藥濃度的相關(guān)性建立測(cè)定甲潑尼龍血藥濃度的方法尤為重要。本研究中建立了測(cè)定血漿中甲潑尼龍質(zhì)量濃度的超高效液相色譜(UPLC)法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；R18 型高速離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；XW－80A 型渦旋混合儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；KL512J 型恒溫水浴氮吹儀（北京康林科技有限公司）；CPA225D 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；MDF－U2086S 型低溫冰箱（日本Sanyo 公司）；KQ－300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲潑尼龍對(duì)照品（批號(hào)為100828－201603，含量為99.8%），地塞米松對(duì)照品（批號(hào)為100129－201506，含量為99.8%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三氯甲烷為分析純；高純度氮?dú)猓ㄊ仪f京聯(lián)實(shí)用氣體有限公司，批號(hào)為20171110）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BSH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈－水（29 ∶71，V／ V）；流速：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：242 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

稱取甲潑尼龍對(duì)照品100 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的甲潑尼龍對(duì)照品溶液，4 ℃冷藏，待用。稱取地塞米松（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品100 mg，同法制備成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的內(nèi)標(biāo)溶液。取適量，用甲醇制得質(zhì)量濃度為1 μg／mL 的工作液，置－40 ℃保存。采集患者清晨空白血漿，備用。

2.3 血漿樣品及質(zhì)控樣品制備

取2.2 項(xiàng)下甲潑尼龍對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.125，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 μg ／ mL 的系列對(duì)照品溶液，置4 ℃保存。分別取20 μL，置10 mL 試管中，40°C 水浴下氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻籽獫{，制得系列對(duì)照品模擬血漿樣品。制備0.3，0.8，2.4 μg／mL 對(duì)照品模擬血漿樣品、對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的模擬血漿樣品。

2.4 血漿樣品處理

取血漿樣品200 μL，置10 mL 試管中，加入地塞米松內(nèi)標(biāo)液20 μL，渦旋，加入三氯甲烷5 mL，渦旋2 min混勻，靜置10 min。取下層有機(jī)相（含藥三氯甲烷）4 mL置5 mL 離心管中。40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，取80 μL 置進(jìn)樣小瓶中，備用。空白血漿處理同上。

2.5 方法學(xué)考察

專屬性考察：取空白血漿及對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的模擬血漿樣品，按2.4 項(xiàng)下方法處理，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。可見，人血漿中甲潑尼龍的分析不受空白血漿樣品內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，甲潑尼龍和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為3.69，4.28 min，兩峰分離較好。

圖1 超高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系與檢測(cè)限、定量限考察：分別取2.3 項(xiàng)下系列對(duì)照品模擬血漿樣品，按2.4 項(xiàng)下方法處理，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以甲潑尼龍質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、甲潑尼龍與內(nèi)標(biāo)峰面積比值( Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝1.106 2 X－0.076 8（R2＝0.998 4，n ＝7）。結(jié)果表明，甲潑尼龍質(zhì)量濃度在0.125 ～3.0 μg／mL 范圍內(nèi)與相對(duì)峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比（S／ N）為3 ∶1 和10 ∶1 計(jì)算得血漿中甲潑尼龍的檢測(cè)限和定量限分別為0.05 μg／mL和0.125 μg／mL。

回收率試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的比值作為方法回收率。取低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項(xiàng)下方法處理，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄甲潑尼龍和內(nèi)標(biāo)及甲潑尼龍對(duì)照品峰面積。以待測(cè)物及對(duì)應(yīng)對(duì)照品峰面積的比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表1。

表1 血漿中甲潑尼龍的回收率試驗(yàn)結(jié)果（%，n ＝5）Tab.1 Results of the recovery test of methylprednisolone in plasma（%，n ＝5）

精密度試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定于1 d 內(nèi)測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線求得甲潑尼龍的實(shí)際濃度，計(jì)算日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d 同法測(cè)定，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表2。

表2 血漿中甲潑尼龍的日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)結(jié)果（n ＝5）Tab.2 Results of the intra－day and inter－day precision test of methylprednisolone in plasma（n ＝5）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品模擬血漿樣品，各5 份，按2.4 項(xiàng)下方法處理，室溫下放置0，2，4，6，8 h 后按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算甲潑尼龍的血藥濃度。結(jié)果的RSD 不超過(guò)4.30%（n ＝5），詳見表3，表明室溫下對(duì)照品模擬血漿樣品放置8 h 穩(wěn)定。取2.3 項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度的甲潑尼龍模擬血漿樣品，各5 份，反復(fù)凍融3 次，按2.4 項(xiàng)下方法處理，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算甲潑尼龍質(zhì)量濃度。結(jié)果的RSD 均不超過(guò)4.00% （n ＝5），詳見表4，表明對(duì)照品模擬血漿樣品反復(fù)凍融3 次后仍穩(wěn)定。同前文“反復(fù)凍融3 次”及按2.4 項(xiàng)下方法處理血樣冰凍7 d，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算甲潑尼龍質(zhì)量濃度。結(jié)果的RSD 均不超過(guò)3.70%（n ＝5），詳見表4，表明對(duì)照品模擬血漿樣品冰凍7 d 后穩(wěn)定性較好。

表3 室溫放置8 h 的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n ＝5）Tab.3 Results of the stability test of methylprednisolone in plasma at room temperature within 8 h（n ＝5）

表4 反復(fù)凍融3 次、冰凍7 d 的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n ＝5）Tab.4 Results of the stability test of methylprednisolone in plasma after three repeated freeze－thaw cycles and 7－day freezing（n ＝5）

3 討論

對(duì)于樣品的處理，預(yù)試驗(yàn)中嘗試了分別以乙腈－水、乙腈－甲酸銨水溶液、乙腈－甲酸水溶液為流動(dòng)相。但觀察到，在水相中加入甲酸銨鹽會(huì)使出峰時(shí)間提前，但會(huì)升高柱壓，峰形無(wú)明顯變化，出于對(duì)色譜柱及經(jīng)濟(jì)環(huán)保考慮，故選擇乙腈－水作為流動(dòng)相。血漿樣品處理常用蛋白沉淀法和液－液萃取法，由于UPLC 儀對(duì)樣品純度要求極高，故試驗(yàn)中采用液－液萃取法。預(yù)試驗(yàn)中曾采用乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、氯仿進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氯仿萃取效果最好，樣品分離度最高，峰形最好，故選擇氯仿萃取。甲潑尼龍又稱甲潑尼龍琥珀酸鈉，為人工合成的中效糖皮質(zhì)激素，臨床主要用于抗炎、免疫抑制、抗休克和抗過(guò)敏，還可通過(guò)聯(lián)合用藥達(dá)到治療目的[4]。其作用機(jī)制包括減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少體內(nèi)自由基，甲潑尼龍可穿過(guò)細(xì)胞膜，阻止核因子（NF）－κB 等轉(zhuǎn)錄因子的通路影響蛋白的轉(zhuǎn)錄[5]。在激素性股骨頭壞死的研究中發(fā)現(xiàn)，激素的使用劑量與壞死范圍和風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。此外，糖皮質(zhì)激素受體的多樣性可能也是導(dǎo)致股骨頭壞死個(gè)體差異的一種因素[6－10]。miRNA 是一類內(nèi)源的、基因編碼長(zhǎng)度為20 ～24 個(gè)核苷酸的小分子RNA，細(xì)胞的許多生理功能受其調(diào)節(jié)，它在激素性股骨頭壞死中有顯著作用，試驗(yàn)證實(shí)，激素尤其是中效激素甲潑尼龍干預(yù)后，miR－672－5pd 在大鼠成骨細(xì)胞的表達(dá)量最大，與此同時(shí)骨壞死的風(fēng)險(xiǎn)隨之增加[11－12]。既往的文獻(xiàn)多采用高效液相色譜法或氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定甲潑尼龍血藥濃度[13－14]，考慮到樣品量及經(jīng)濟(jì)成本，本研究中建立了快速、高效的UPLC 法測(cè)定血漿中甲潑尼龍的質(zhì)量濃度，擬用此方法測(cè)量使用甲潑尼龍患者的血藥濃度，以更好地預(yù)防藥品不良反應(yīng)，為臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)。本研究不足之處在于，僅建立了相關(guān)測(cè)定方法及進(jìn)行了方法學(xué)考察，并未對(duì)患者的真實(shí)血樣進(jìn)行測(cè)定。后續(xù)需就此開展進(jìn)一步研究。