家蠶耐氟性抗血液型膿病品系選育研究

黃　凌

家蠶耐氟性抗血液型膿病品系選育研究

黃凌

（廣西壯族自治區蠶業科學研究院廣西南寧530007）

將家蠶抗血液型膿病品種的抗性親本與耐氟化物品種的抗性親本進行雜交，從后代中篩選出兼耐血液型膿病和氟化物的家蠶個體，用系統選育的方法進行家蠶抗病性品種選育。經測試，新品系2齡起蠶經口添食家蠶核型多角體病毒（BmNPV，以下簡寫為NPV），半數致死濃度（LC50）為2.18×108個/mL，并且耐受一定濃度的含氟桑葉。在正常環境條件下，該品系的蟲蛹率與對照932不相上下，但在環境受NPV污染的情況下，該品系的蟲蛹率明顯高于對照932。因此，經本研究表明，品系96·NC99R對血液型膿病和氟化物兼具一定耐受性，表現出較強的抗逆性。

家蠶抗病材料；血液型膿病；氟化物

家蠶核型多角體病毒（BmNPV，以下簡稱為NPV）經食下感染或傷口感染后，通常使家蠶于下一齡期發病或蛹期發病，100%致死，死蠶尸體污染蠶座致使其他蠶兒感染發病，嚴重可使整批蠶感染病毒致死。桑葉受工廠氟化物污染后出現氟化物中毒，蠶兒食下氟化物中毒的桑葉后出現氟化物中毒癥狀，環節凸起，發育開叉大，吐絲量減少，嚴重的可能不結繭，產不出受精卵等。不管是NPV感染或是氟中毒，蠶兒一旦發病或中毒，尚無有效的治療或解毒方法，現階段只有消毒防控和培育抗逆性家蠶品種這兩種有效方式。有研究結果表明，家蠶耐氟性狀呈部分顯性遺傳，有加性效應，由一對耐氟主效基因和若干微基因控制，該耐氟基因與第12連鎖群緊密連鎖，F1代耐氟性與雜種優勢呈顯著正相關，與父本為顯著負相關，并且可以較容易地通過表型選拔獲得耐氟性個體[1-5]。與耐氟性相似，家蠶對NPV的抗性同樣受若干微基因和一對主效基因控制，該抗性基因為顯性基因，雜交后代（F1代和F2代）對NPV的抗性呈偏父遺傳現象，雜交一代（F1代）的抗NPV性表現出雜交優勢，累代添食NPV可提高家蠶品種對NPV的抗性，且經濟性狀穩定[6-7]。至今已培育出的抗NPV家蠶品種或耐氟家蠶品種有桂蠶N2、華康3號、秋豐×白玉和桂蠶F95等[8-11]，然而，這些品種均只是單一的抗血液型膿病或耐氟化物，尚未報道有家蠶品種兼抗兩者。因此，本研究擬將含有抗NPV基因的家蠶品種親本與含有耐氟基因的家蠶品種親本雜交，對其后代進行抗NPV和耐氟性篩選，并累代添毒添氟以提高個體的抗病性和耐毒性，采用系統選育的方法選育出兼抗血液型膿病和耐氟化物的家蠶品系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

家蠶母種NC99R與96均由廣西蠶業技術推廣站育成并保存，均為二化性中系品種。其中NC99R攜帶抗NPV顯性主效基因，為抗家蠶血液型膿病品種桂蠶N2的親本之一；96攜帶耐較高濃度氟化物顯性主效基因，為耐氟化物品種桂蠶F95的親本之一。

1.2 飼育方法

96·NC99R和對照932均在平均溫度29 ℃、平均濕度81%的飼育環境中飼育，1齡～3齡全覆蓋育，4齡半覆蓋育，5齡普通育，每天3回育，并調查齡期經過、簇中經過、飼育成績和繭質成績。

1.3 抗NPV性篩選與提升

將提純的NPV病毒原液稀釋成3×106個/mL備用（隨配隨用）。添食當天摘取新鮮適熟葉，浸泡入制備好的NPV病毒液中，充分浸漬均勻，取出后待桑葉表面水分自然蒸發后，切成4 cm×4 cm的方塊。2齡餉食第一口葉開始定量添食，每30 頭蠶在24 h內一次性喂給4 cm×4 cm的浸漬過NPV的桑葉3 片，待24 h食盡后用新鮮石灰粉消毒蠶座，更換蠶座紙，開始換為普通桑葉正常飼喂，3齡起蠶后淘汰掉不抗NPV的病蠶。

1.4 半數致死濃度（LC50）的測定

將NPV病毒原液稀釋成1×104個/mL、1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL、1×108個/mL和1×109個/mL共6 個濃度，添食方法同1.3。3齡第2天開始統計死亡與存活的蠶頭數，每個濃度梯度攻毒2 個重復區，每個重復區30 頭蠶。

1.5 耐毒性篩選與提升

準確稱取氟化鈉（NaF）分析純試劑3 g，加入10 kg清水稀釋后得到300 mg/L的NaF溶液，NaF溶液宜即配即用。將新鮮適熟桑葉浸入300 mg/L的NaF溶液中，充分浸漬10 min后撈出晾干備用。自3齡餉食至3齡眠下，連續添食制備好的含氟桑葉（實測含氟量237 mg/L），過程中選留不出現氟化物中毒癥狀的家蠶個體。

1.6 統計分析

獲得的實驗數據通過MicrosoftExcel 2007軟件錄入和處理，半數致死濃度的計算參考Reed-Muench法。添食NPV病死率與蟲蛹率的顯著性分析用卡方檢驗進行計算，所用軟件為SPSS 24.0。

2 結果與分析

2.1 品系96·NC99R的選育

以含有耐氟化物基因載體的家蠶母種96為母本、以含有抗NPV基因載體的家蠶母種NC99R為父本，雜交的后代（暫命名為96·NC99R）為F1代。為了固定新品系的耐氟能力，再以96為父本連續回交3次，使后代中耐氟化物品種的理論遺傳成分占93.75%，抗NPV品種的理論遺傳成分占6.25%（見表1）。

表1回交后代群體中2個親本的遺傳成分理論值

飼養時間回交次數世代親本遺傳成分占比/%回交后代基因型組成NC99R96 2017.30F15050NnFf 2017.51BC12575NnF_ 2017.62BC212.587. 5NnF_ 2017.93BC36.2593.75NnF_

注：含有抗NPV主效基因的家蠶品種的基因型為NNff，含有耐氟化物主效基因的家蠶品種的基因型為nnFF，其中N對n為顯性，F對f為顯性，F_表示基因型為FF或Ff。

最后一次回交的后代設定為B1世代，從B1世代開始，進行抗病性和耐毒性的選拔提高。2齡餉食經口添食NPV攻毒篩選抗性個體，3齡期添食含氟桑葉篩選耐毒性個體（詳見材料與方法1.3和1.5）。B1～B6世代全部混區飼養，混區制種。

2.2 抗血液型膿病的鑒定

在添食NPV濃度為106個/mL的數量級下，品系96·NC99R與對照932的死蠶率見表2。品系96·NC99R的病死率平均為7.14%，對照932的病死率平均為69.91%[12]，差異極顯著（<0.01），說明96·NC99R的抗NPV性高于932，兩個品系的抗病性有差異，且差異極顯著。將NPV病毒原液稀釋成1×104個/mL、1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL、1×108個/mL和1×109個/mL的6個濃度進行添食處理（結果如表3所示），按Reed-Muench法計算出品系96·NC99R的半數致死濃度為2.19×108個/mL。

如表4所示，在蠶室受NPV污染的情況下飼養，96·NC99R的蟲蛹率為43.93%，而對照932的蟲蛹率為6.94%，差異極顯著（<0.01）；在正常情況下飼養，96·NC99R的蟲蛹率為89.41%，而對照932的蟲蛹率為90.25%，差異不顯著（>0.05）。可見在正常情況下，96·NC99R的蟲蛹率和對照932不相上下，而在遭受NPV污染的情況下，96·NC99R的蟲蛹率與對照932的蟲蛹率差異極顯著，而且新品系的蟲蛹率要高于對照932，說明96·NC99R的抗NPV性優于對照932。

表2品系96·NC99R與對照的抗病性比較

品種名NPV濃度/個/mL死蠶數活蠶數死蠶率/% 96·NC99R3×1064527.14 對照932[12]3×10641718069.91

注：對照932的實驗數據摘自文獻《家蠶抗氟品種“桂蠶F95”的選育研究》[12]。

表3品系96·NC99R添食NPV梯度濃度的實驗結果

病毒稀釋度/個/mL1×1041×1051×1061×1071×1081×109 接毒蠶數273029263026 活蠶數252525212420 NPV死蠶數254566

表4品系96·NC99R與對照932的飼養情況比較

飼養條件蟲蛹率/% 96·NC99R對照932 蠶室正常情況89.4190.25 蠶室受NPV污染43.936.94

2.3 耐氟化物的鑒定

3齡起蠶淘汰掉不抗NPV的家蠶個體后，就開始進行氟化物的添食篩選（詳見材料與方法1.5）。從圖1中可以看出，添食氟化鈉后，96·NC99R和932都出現了環節凸起等氟中毒現象（圖1中C和D），但932的蠶頭數明顯比96·NC99R少，而且蠶個體明顯比96·NC99R瘦小，發育不齊（圖1中A和B）。在添食NPV又連續添食氟化鈉后，932蠶無法結繭化蛹，表現出更嚴重的氟化物中毒癥狀。

（A、C：添食氟化物后的96?NC99R。B、D：添食氟化物后的932。）

3 討論

本研究用兩個抗性親本雜交，使得抗NPV顯性基因與耐氟顯性基因均整合至96·NC99R上，為鞏固F1代的耐氟性又與96親本進行連續三代回交，回交后代在高溫多濕環境下飼養，通過累代添氟添毒，選拔抗性個體進行留種繼代，以提升新品系的抗病性和耐毒性。

試驗結果表明，新品系的食下感染半數致死濃度為2.19×108個/mL，比它的抗病親本NC99R低[8]。在添食NPV濃度為106個/mL的數量級下，新品系96·NC99R的病死率比兩廣二號的親本932低62.77%，差異極顯著（<0.01），說明品系96·NC99R與932的抗病性有極顯著差異。在正常情況下飼養，96·NC99R的蟲蛹率比932低0.84%，差異不顯著（>0.05）；在蠶室遭受NPV污染的情況下，96·NC99R的蟲蛹率比932高36.99%，差異極顯著（<0.01），說明96·NC99R與932的蟲蛹率可能存在差異，但差異還未達到顯著水平。而96·NC99R的抗病性與932的抗病性差異極顯著，說明品系96·NC99R含有抗NPV主效基因，對NPV有相當好的抗性。3齡起蠶至3齡眠下連續添食含氟桑葉，進行耐氟性篩選，通過累代篩選出耐氟化物個體留種繼代，可以逐步提升96·NC99R品系的耐氟性。

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S882

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2095-1205(2021)08-01-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2021.08.01