小鼠胚胎培養在新建體外受精胚胎培養室質量控制中的作用

張花錦，王鴻周，周廣義，張晨靜，韓玉芬

(濮陽市婦幼保健院 生殖醫學中心，河南 濮陽 457000)

我國近期調查結果顯示，國內不孕癥患者占已婚夫婦人數的10%左右，比1984年調查的4.8%增加一倍多，發病率呈上升趨勢。體外受精—胚胎移植技術已成為一項針對不孕不育行之有效的人類輔助生殖技術，其中人類胚胎實驗室則是生殖醫學中心的關鍵，因為胚胎培養是不孕不育治療環節中很重要的一環。高質高效的實驗室環境對于胚胎的生長發育及胚胎實驗室的成功率都起著非常重要的作用[1]。體內精卵結合及發育是在無菌無塵無味無毒避光的環境下發生的，而體外培養過程中配子、胚胎離開了母體穩定安全的環境，沒有了母體的所有保護屏障，對體外整個培養體系發生的任何微小變化都會非常敏感，可能會降低胚胎的發育潛質，甚至發生遺傳層面的基因突變。對于濮陽市婦幼保健院新建的胚胎培養實驗室，胚胎培養實驗室的環境溫度和濕度、儀器設備的性能、試劑耗材的質量及實驗室人員操作熟練程度等，是否能達到配子(精子和卵子)及胚胎體外操作和生長發育的要求相當關鍵[2]。

因此，在實驗室啟動人類胚胎培養前，為了保證精卵順利結合及胚胎發育的培養穩定可靠，有必要對胚胎實驗室整個培養體系進行質量控制。小鼠胚胎生物學檢測已成為評估新建IVF 實驗室最為常用的方法[3]。本院生殖醫學中心于2019年2月底建成IVF 實驗室，為了去除裝修中及新購置的儀器設備產生的揮發性有機物(VOC)，經過通風處理4 個月后，先后兩次對建筑材料以及實驗室環境進行VOC 檢測，結果均合格。2019年7月至2019年8月，在本中心人體外受精SOP 操作規范下，購置昆明小白鼠行體外體內受精進行胚胎實驗室體外培養實驗，以進行新建實驗室的質量控制，提供可靠的實驗數據和質量控制，從而保證本中心人類輔助生殖技術體外胚胎培養能順利開展。體內受精—胚胎培養實驗共10 批次，體外受精—胚胎培養實驗共6 批次，其實驗過程總結如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明系小白鼠，雌鼠4～6 周齡，體重約25 g；雄鼠6～8 周齡，體重約30 g，均購自鄭州大學實驗動物中心[ 合格證號SCXK(滬)2017-0005]。在控光(日照約10h，8：00—18：00)、控溫(23±2)℃，自由飲水攝食恒定環境下喂養5～7 d，適應后再用于實驗。

1.2 藥品與試劑

注射用孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，購自寧波三生生物科技有限公司。采用瑞典Vitrolife 培養液系列：卵泡收集液G-MOPSPLUS、梯度法精子洗液SpermGrad、洗精受精液G-IVFPLUS、卵裂胚培養液G-1PLUS、囊胚培養液G-2PLUS、OVOIL-100 石蠟油等培養液均在使用前一天下午專用培養皿制作液滴后置于37℃，6% CO2培養箱過夜平衡。G-MOPSPLUS 置于37℃不通氣培養箱過夜平衡。

1.3 耗材與設備

培養皿、巴斯德管、移液管、2099 離心管等均為美國Falcon 公司產品，均為一次性耗材。CO2氣體純度為99.999%，日本ASTEC 三氣水套式培養箱四臺(編號1、2、3、5)，日本ASTEC 抽屜式培養箱(編號6-1，6-2、6-3、6-4共四個抽屜)，美國Thermo 二氧化碳培養箱(編號7、8)。

1.4 小鼠超促排卵

將PMSG 和HCG 干粉均用專用稀釋液配制成100IU/mL 溶液，適量分裝保存于-20℃環境下。每只雌鼠17：00 腹腔內注射PMSG10IU，48 h 后再腹腔內注射HCG10IU[4-5]。

1.5 小鼠體內受精實驗

分10 批次，每批次選6 只健康雌鼠，HCG 注射后1h 左右將雌雄小鼠以1∶2 比例合籠(為保證交配成功)，次日早上檢查陰道栓，確認是否受精，如有陰栓則提示受精。20～22 h 后(次日15：00)雌鼠以頸椎脫臼法處死，實施酒精消毒背部無菌操作，取出輸卵管，將收集的所有輸卵管放置于G-MOPSPLUS 液滴里，顯微鏡下找到輸卵管膨大部(能隱約看到鼠胚細胞團)，用專用鑷子解剖，輕輕刺破，可見小鼠卵子團釋放出來，并將其收集到體外操作G-MOPSPLUS 皿中，透明質酸酶脫顆粒后將其放置于卵裂胚培養液G-1PLUS 液滴中，每個液滴最多放10 個卵，快速觀察受精情況并記錄受精率，然后置于37℃，6% CO2培養箱中培養。

1.6 小鼠體外受精實驗

分6 批次，鼠精的收集：每批2 只健康雄鼠，取卵日實施頸椎脫臼法處死，酒精消毒小腹部，無菌操作取出附睪尾，于G-MOPSPLUS 中用專用眼科鑷子從一端順著一個方向向另一端輕輕擠壓，多次反復，盡可能多地收集精液，一只使用密度梯度離心法處理精液，另一只使用上游法處理精液[6]。精液優化處理與收集方法來自本實驗室依據黃國寧老師《輔助生殖實驗室技術》新編寫的標準操作規程。精子優化處理后G-IVF 液重懸裝于2099 離心試管中，置于37℃，6% CO2培養箱中獲能30 min 左右即可。

鼠卵收集：每批次選5 或6 只健康雌鼠，HCG 注射14 h 后實施頸椎脫臼法處死雌鼠，酒精消毒背部無菌操作取出輸卵管，將收集的所有輸卵管放置于G-MOPSPLUS 液滴里，解剖顯微鏡下找到輸卵管膨大部(能隱約看到鼠胚細胞團)，用專用鑷子，輕輕刺破，可見小鼠卵子團釋放出來，并將其收集到體外操作G-MOPSPLUS 皿中沖洗3 次，并分別將其轉移至G-IVF受精液滴中，每1 卵子團放1 個液滴中，放置于37℃，6%CO2培養箱中等待受精。

體外受精：顯微鏡下觀察獲能后的精子活力與濃度，取適量精子懸液加至待受精卵子細胞團的液滴中，使培養滴中精子濃度調到約5.0×106/mL，置于37℃，6%CO2培養箱中培養受精，4～6 h 后將卵子在G-1PLUS液清洗3 次后置于卵裂培養G-1PLUS 液滴中，觀察受精情況并記錄，于37℃，6% CO2培養箱中繼續培養。

1.7 原核及卵裂期胚胎的觀察與培養

D0：16：00 點左右觀察第二極體和原核，記錄受精情況，并將其轉至已過夜平衡的卵裂培養液G-1PLUS中繼續培養；D1：上午觀察2 細胞并記錄；D2：上午觀察4 細胞期胚胎，下午觀察8 細胞期胚胎，并將其轉至已過夜平衡的囊胚培養液G-2PLUS 中繼續培養；D3：上午觀察桑椹胚并記錄；D4：上午早期囊胚觀察；D5～D6：上午囊胚觀察并記錄。

參考本中心SOP 統計實驗數據，如受精率、卵裂率和囊胚形成率，其中受精率=受精數/獲卵數；卵裂率=2C胚胎數/ 受精數；囊胚形成率= 囊胚數/8C 胚胎數。

1.8 數據分析

采用統計學軟件SPSS 19.0 進行數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體內受精實驗結果

本鼠胚實驗共進行10 批次，共收集到1 478 枚卵，其中2PN 細胞1 378 枚，分別放入不同培養箱中培養。見表1。

表1 小鼠體內受精及不同培養箱胚胎培養統計

2.2 體外受精實驗結果

本鼠胚實驗共進行6 批次，共收集到721 枚卵，體外受精后獲2PN 細胞665 枚，囊胚形成581 枚，囊胚形成率約為87.01%，培養結果見表2、表3；其中1～6 批次一部分小鼠精液洗滌處理采用上游法，另一半采用密度梯度離心法，密度梯度離心法處理精液后其受精率高于上游法，組間差異有統計學意義(P＜0.05)，組間卵裂率和囊胚形成率比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表2 小鼠體外受精—上游法精液洗滌處理后胚胎培養統計

表3 小鼠體外受精—密度梯度離心法精液洗滌處理后胚胎培養統計

表4 小鼠體外受精—不同的精液洗滌處理方法對胚胎培養影響統計

2.3 抽屜式與非抽屜式培養箱培養小鼠胚胎發育結果比較統計

經分析，日本ASTEC 三氣水套式培養箱(編號1、2、3、5)和美國Thermo 二氧化碳培養箱(編號7、8)培養結局比較無統計學意義，日本ASTEC 抽屜式培養箱(編號6-1，6-2、6-3、6-4 共四個抽屜)培養卵裂率為96.06%，與非抽屜式培養箱培養結局比較無統計學意義(χ2=0.799，P=0.371，P＞0.05)；囊胚形成率91.91%，明顯高于非抽屜式培養箱，差異有統計學意義統計(χ2=6.034，P=0.014，P＜0.05)。見表5。

表5 抽屜式與非抽屜式培養箱培養小鼠胚胎發育結果比較統計

3 討論

胚胎實驗室是輔助生殖技術整個鏈條里的核心，這是輔助生殖技術與其他學科最大區別所在，建立穩定可靠的胚胎實驗室，將有助于輔助生殖技術的成功。實驗室在開展人類輔助生殖技術之前，必須檢測其培養體系是否適合胚胎的培養，而鼠胚實驗能夠有效檢測對胚胎有害的毒性環境，且有較高的敏感性。鼠胚實驗的初始變量可以是配子、合子或者2 細胞胚胎，最終觀察指標是囊胚形成情況[7-8]。因本中心是新建實驗室，采取體內體外兩種受精方式收集更多的實驗數據來檢測整個培養體系及胚胎實驗人員的操作技能。

兩組實驗昆明系小鼠詳細記錄2- 細胞胚胎體外培養情況，在新建人體外受精培養室環境下，體內受精實驗共進行了7 批次，共獲卵1 478 枚，2PN 1 378 枚；體外受精實驗共進行6 批次，共獲卵721 枚，2PN 665 枚。體內體外兩種受精方式受精率卵裂率囊胚形成率均達到胚胎實驗室質量控制標準。說明鼠胚實驗體內體外兩種受精方式均能用于胚胎培養體系的質量控制與管理。體內受精組共收集到1 378 枚受精卵，形成2 細胞1 324枚，囊胚形成1 184 枚，囊胚形成率89.42%，結果證實實驗室培養環境合格。同時將獲得的鼠胚隨機放入10 臺培養箱中(實驗室培養啟動后用于人類胚胎培養)，統計所有培養箱中囊胚形成情況，結果顯示，經過72 h 培養，所有培養箱能發育到囊胚期或孵化囊胚階段的2 細胞胚胎達到80%以上，符合輔助生殖實驗室質量控制標準[7-8]。其中抽屜培養箱囊胚形成率更高，抽屜式培養箱與其他非抽屜式培養箱相比，囊胚形成率比較差異有統計學意義(P＜0.05)，說明實驗室所有培養箱都合乎培養要求，并且抽屜式培養箱更適合培養囊胚，從而指導實驗室囊胚培養時首選抽屜式培養箱。而受精率與卵裂率差異比較無統計學意義(P＞0.05)。原因有三：(1)抽屜式培養箱為CO2、O2、N2三氣同時供應，培養環境更穩定，更接近人體內胚胎發育環境要求。(2)抽屜式培養箱與非抽屜式培養箱相比，優化的腔體內部空間設計，大幅度提高了溫度，CO2、O2、N2三氣的恢復速度，以保證胚胎培養環境穩定。(3)抽屜式培養箱氣體比例更精準化，更利于囊胚培養。有研究證明[9]，低比例氧氣含量的大氣環境可以提高囊胚的形成率。本次實驗不僅加強和提高了胚胎實驗室人員操作熟練程度，更規范和改善了實驗技術能力，在以后工作中，囊胚培養盡量選擇抽屜式培養箱培養法則。

上游法與密度梯度離心法是目前輔助生殖技術精液處理最常用的精子優化方法。有實驗研究表明[10]研究表明，密度梯度離心法精子回收率及精子質量高于上游法。本實驗結果顯示，兩組使用密度梯度離心法和上游法處理精液后所獲得的受精率比較，差異有統計學意義，密度梯度離心法獲得的受精結局明顯優于直接上游法。原因分析可能為以下三點：(1)與精子上游法相比，密度梯度離心法能更好地分離精子和非細胞及碎片，從而回收更多形態正常的精子，并且明顯增加精子的活力和體外生存能力[11]。(2)密度梯度離心法處理精子時，活力好及形態正常的精子回收率高，從而提高精卵結合的可能性。(3)上游法處理精子，需要精液與培養液共同放在培養箱孵育1h，時間較長。研究表明[12]上游法處理精子會增加精子代謝產物活性氧的生成，造成精子氧化損傷，從而影響精卵結合能力。實驗中也發現，上游法處理精子，每一條活動精子不可能都會發生上游，活動精子回收率不能保證，有時操作過程中上游液與底部精液分界面分辨不清，回收精子中不動精子增多，卵細胞受精時活動精子濃度較低，不能達到本實驗室SOP 要求(活動精子濃度不小于5.0×106/mL)，從而降低精卵結合的機會。

綜上所述，輔助生殖技術過程中，精液優化推薦采用密度梯度離心法，特別是針對精液活力及濃度分析質量比較差的人群。兩種精液處理方法對卵裂率和囊胚形成率無顯著影響，原因可能是卵細胞精卵結合時的選擇也是優勝劣汰，優選的精子更有可能與卵細胞結合，兩種方法產生的胚胎發育環境是一致的，精液優化處理方法對胚胎發育影響可能比較小，差異無統計學意義，同時也證實了整個胚胎培養體系、培養環境及胚胎師操作技能已經達到質控要求。

胚胎實驗室質量控制一直是胚胎學家工作的重點。但是，配子收集、受精以及胚胎培養等過程復雜，影響因素眾多，因此也是難點。鼠胚實驗已成為評估新建輔助生殖胚胎實驗室最為常用的方法，黃國寧老師的《輔助生殖實驗室技術》也曾提到，鼠胚實驗是檢測培養體系是否合格，更是規范整個胚胎培養體系，標準化培養過程，更接近體內環境下胚胎發育過程。整個鼠胚實驗，在胚胎實驗室標準操作規程嚴格執行前提下，使得實驗人員的操作技術以及操作熟練度得到了很大的完善和提高。實驗中收集的數據均已達標，給我們以后開展工作增強了信心。但必須明確一點，鼠胚培養結果不能完全反映人類胚胎的安全性，沒有任何一種方法可以配子、胚胎的發育及存活的檢測試驗，但這些實驗可以檢測對胚胎有害的毒性環境[1]。可見，鼠胚實驗依舊是一個需要不斷改進的胚胎生物檢測系統，也督促實驗室人員在以后工作中完善實驗數據完整收集與整理，做好實驗室數據質控，形成持續性胚胎實驗室質量控制模式，發現問題，分析問題，保證后期結果的穩定性。