MMP-13、BMP-2及P16在退變腰椎間盤髓核中的表達及臨床意義

張培根 張文 解迪 王進

腰椎間盤退變是臨床上引發腰椎管狹窄、腰椎間盤突出及慢性下腰痛等疾病的病理基礎。近年來，腰椎間盤退變的發病率呈現不斷上升趨勢［1］。目前本癥的發病機制尚未明確，相關研究顯示其與細胞及細胞外基質變化有關，因此，探索腰椎間盤退變的細胞學機制，早期采取生物學干預對疾病轉歸具有重要意義［2］?；|金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）為重要基質降解酶家族成員之一，相關研究顯示，應力負荷對腰椎間盤退變具有誘導作用，且與退變椎間盤中MMP-13 水平變化密切相關［3］。骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic pmtejn-2，BMP-2）是調節椎間盤細胞外基質合成代謝的重要因子，對調節細胞生長、分化、凋亡具有重要作用［4］。P16 為細胞周期G1-S 中的分子信息傳導途徑，可調控多種腫瘤細胞周期和細胞分化［5］。本研究就MMP-13、BMP-2 及P16 在退變腰椎間盤髓核中的表達及臨床意義進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月至2020年8月于本院進行手術治療的90 例腰椎間盤突出癥患者的髓核組織為研究組，其中男68 例，女22 例，平均年齡（50.51±7.74）歲，平均病程（8.15±3.51）年，髓核摘除位置為：L4/5、L5/S1。納入標準：①符合腰椎間盤突出癥的療效評定標準與康復標準［6］；患者均有明顯腰痛、坐骨神經痛等癥狀，下肢受累神經支配區域皮膚感覺減退，直腿抬高試驗（+），影像學檢查可見椎間盤間突出所致椎管狹窄。②本研究已獲得本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書，且臨床資料完整。排除標準：①合并肝、腎、心、肺等重要器官功能不全者；②合并血液系統、免疫功能疾病者。③存在精神疾患無法配合本研究者。根據pfirrmann［6］分級，在T2W1 序列上將椎間盤退變分Ⅰ～Ⅴ級，其中研究組患者處于Ⅲ級：16 例，Ⅳ級：35 例，Ⅴ級：39 例。納入同期于本院進行前路或后路腰椎骨折手術治療的50 例患者經病理及MRI 證實為正常椎間盤組織為對照組。男37 例，女13 例，平均年齡（50.57±7.75）歲，取材部位為：T12/L1、L1/2，pfirrmann 分級Ⅰ～Ⅱ為級。兩組基線資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 標本采集和制備

所有患者在手術治療中，予以髓核標本切除，標本切除后立即用無菌生理鹽水清洗，將標本分為兩份，其中一份標本密封放置于液氮中凍存。另一份標本5 min 內放入中性福爾馬林溶液中固定24 h，之后進行石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。每個標本切10 張切片。

1.3 MMP-13、BMP-2 及P16 表達水平檢測

MMP-13、P16 檢測試劑盒由美國abcam 公司提供；BMP-2 檢測試劑盒由漢博士德生物工程有限公司提供。采用免疫組織化學方法進行：鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法［7］，將石蠟標本進行切片、烘烤、脫蠟、浸泡。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

判斷MMP-13、BMP-2 及P16 是否表達的方法和標準［7］：每張切片在鏡下分別以低倍鏡及高倍鏡進行觀察，對每張切片上中下及里外中9 個位置進行觀察，用Medja Cvberne’s 圖像分析軟件計算出每張切片的平均灰度值，最后對2 位專家判斷結果進行比對（差異較大時，需重新同時共同讀片確定）。

采用Volm 雙評分法［8］進行判定，在染色均勻的髓核區，選取5 個高倍鏡視野（×400）：按陽性細胞百分率（A 值）評分：＜25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3 分；按染色強度（B 值）評分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。綜合染色陽性細胞數與染色強度判斷結果［8］：陰性（-）：0 分，弱陽性（+）：1～2 分，中度陽性（++）：3～4分，強陽性（+++）：5～6 分；兩種計分的乘積為每例的加權分數，加權分數為0 為陰性，其余均為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，行t檢驗；計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗，椎間盤退變等級與MMP-13、BMP-2 及P16 水平的相關性使用Pearson相關系數分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MMP-13、BMP-2 及P16 水平比較

研究組MMP-13、BMP-2 及P16 陽性表達率高于對照組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組MMP-13、BMP-2 及P16 水平比較［n（%）］Table 1 Comparison of MMP-13，BMP-2 and p16 levels between 2 groups［n（%）］

圖1 免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 Degenerated lumbar intervertebral disc nucleus pulposus（SP，×500）

2.2 兩組MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平比較

研究組患者MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平比較（±s）Table 2 Comparison of average gray level of MMP-13，BMP-2 and p16 between 2 groups（±s）

表2 兩組MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平比較（±s）Table 2 Comparison of average gray level of MMP-13，BMP-2 and p16 between 2 groups（±s）

組別研究組對照組t 值P 值n 90 50 MMP-13 71.26±10.41 184.52±26.74 35.685＜0.001 BMP-2 76.21±9.57 191.06±21.33 43.838＜0.001 P16 70.03±10.41 186.74±24.06 39.869＜0.001

2.3 退變腰椎間盤髓核MMP-13、BMP-2 及P16表達與椎間盤退變等級的關系

Pearson相關系數分析顯示，退變腰椎間盤髓核MMP-13（r=0.983）、BMP-2（r=0.852）及P16（r=0.974）表達與椎間盤退變等級呈正相關關系，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

腰椎間盤退變主要以椎間盤細胞稀少，基質豐富，蛋白多糖聚合體解聚，硫酸角質素和硫酸軟骨素的比例增高，水分喪失和膠原類型改變引起的臨床變化［9］。

椎間盤結構對維持椎間盤內環境穩定性具有重要作用。既往學者認為，維持椎間盤完整性主要依靠維持椎間盤基質合成及降解平衡，一旦失衡可對椎間盤功能特性造成損害［10］。BMP 為椎間盤細胞外基質關系密切的細胞因子，相關椎間盤細胞研究發現，對椎間盤細胞分裂培養并用BMP-2進行干預可促進椎間盤細胞Ⅱ型膠原表達及蛋白多糖分泌，考慮BMP-2 對人腰椎間盤退變發揮一定作用［11］。BMP-2 作為生長因子，主要通過內分泌、旁分泌及自分泌機制發揮生物學功能，國內外學者曾提出椎間盤退變的病理基礎與細胞外基質減少有關，而BMP-2 表達增強對細胞外基質Ⅱ型膠原和蛋白多糖具有保護性［12］。本研究顯示，BMP-2 水平在腰椎間盤髓核中呈高表達狀態，且平均灰度值水平低于正常椎間盤組織者。椎間盤退變的病理基礎是細胞外基質中的Ⅱ型膠原和蛋白多糖減少，BMP-2 異常表達有力提示BMP-2 參與椎間盤的新陳代謝并可能作為椎間盤重建修復中的合成代謝過程重要組份，對抗椎間盤內的分解代謝過程［13］。

MMP-13 又稱膠原酶3，對膠原分子具有較強的特異性，可分裂三維螺旋結構，是現臨床對軟骨研究中較多的膠原酶。研究發現，退變椎間盤損傷的原因與膠原抗體對軟骨細胞、硫酸多糖、膠原等合成具有阻礙作用有關［14］。而MMP-13 作用底物主要表達于滑液及軟骨中，可使Ⅱ型膠原變性裂解，故相關學者認為MMP-13 表達增高是椎間盤退變損傷并形成惡性循環的原因之一［15］。

P16 作為CDK4 和CDK6 的抑制劑，可抑制細胞周期蛋白復合物活性，導致細胞老化。本研究結果顯示，MMP-13、P16 在退變腰椎間盤患者中處于高水平狀態。P16 對軟骨細胞的Ⅱ型膠原有重要的降解作用，可參與椎間盤退變過程，加重損傷。Yong 等［16］的實驗表明，隨年齡增加及椎間盤退變程度加重，椎間盤細胞中SA-β-gal 陽性細胞增加，MTL 羧酸降低細胞分裂能力，引起P16 免疫陽性細胞數增加，且退變椎間盤髓核細胞P16 水平隨MMP-13 表達增加而增加，進一步佐證MMP-13、P16 與退變腰椎間盤病情發展關系密切。

此外，pfirrmann 分級是臨床上反映退變腰椎間盤病程的重要診斷依據，對病情的不同階段提供了參考依據，能更確切地反映疾病所處的具體階段和病變嚴重程度。本研究結果顯示，退變腰椎間盤髓核MMP-13、BMP-2 及P16 表達與椎間盤退變等級呈正相關，考慮與MMP-13、BMP-2 及P16 參與椎間盤退變活化調控發揮了重要作用有關。但關于三者具體作用機制尚未明確，未來將擴大樣本量，進一步論證MMP-13、BMP-2 及P16 表達與椎間盤退變等級的關系。

綜上所述，MMP-13、BMP-2 及P16 水平在退變腰椎間盤髓核中呈異常表達狀態，且與椎間盤退變等級顯著相關，其表達情況可作為評估椎間盤退變程度的可靠依據。