SETDB1在炎癥性腸病患者腸黏膜組織中的表達及臨床意義

王慧玲 趙靜 李剛

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD），主要包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）及潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC），是一種消化道的非特異性炎性病變，該病好發于15～30 歲的青壯年，病情遷延反復、難以治愈，致殘率高［1-2］，嚴重影響了患者的生活質量，給患者家庭乃至社會帶來極大的經濟負擔，已成為當今國際消化學界的研究熱點和難點之一［3］。本研究前期研究顯示：腸黏膜屏障功能障礙可能是IBD 發病機制中的重要因素之一［4-5］。最近有研究發現組蛋白甲基化轉移酶1（SET domain bifurcated1，SETDBl）的缺失與腸道上皮細胞分化，屏障破壞，炎癥和死亡有關，SETDB1 的缺失會導致內源性逆轉錄病毒沉默，DNA 損傷和腸上皮細胞死亡［6］。另有動物實驗證明，腸道干細胞中SETDB1 的丟失解除了對內源性逆轉錄病毒的抑制作用，不可逆轉地破壞了上皮屏障的穩態，SETDB1 降低的小鼠可引起自發性終末回腸炎和結腸炎［7］。上述研究共同表明：SETDB1 可能在腸道上皮穩態中起著至關重要的作用。但SETDB1 在IBD 患者中的具體表達及其與IBD 患者疾病活動度的關系，目前尚未見報道。本研究通過檢測SETDBl 的mRNA 及蛋白在IBD 患者腸黏膜組織中的表達情況，分析其與IBD患者疾病活動度的相關性，為IBD 的診療及IBD發病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 IBD 患者標本的收集

收集河南省人民醫院2016年9月至2020年9月期間收治的門診及住院病例，分UC 組、CD 組和對照組（各50 例），并收集患者的相關炎癥指標。從IBD 病變活動部位取材，以健康體檢者的腸鏡活檢組織或單純結腸腺瘤患者肉眼和組織學表現均正常的結腸區域標本為對照，非炎癥部位腸黏膜（對照和IBD 患者）和炎癥部位腸黏膜（IBD 患者）各取4 塊組織；分別用于RNA，蛋白質提取及石蠟包塊。本研究參與的患者均知情同意并簽署知情同意書，本實驗已通過院倫理委員會的審批。CD 和UC 的診斷參考之前的標準。CD 和UC疾病活動度分別以CD 活動指數CDAI 評分及UC活動指數Mayo 評分作為參考［8］。納入標準：①炎性腸病的診斷標準參考《炎性腸病診斷與治療的共識意見（2012年廣州）》中的標準［9］；②經腸道鏡檢查、病理學活檢證實；排除標準：①惡性腫瘤；②腸道梗阻、穿孔；③嚴重出血、凝血功能障礙；④自身免疫性疾病；⑤其他腸道疾病。

1.2 主要試劑及儀器

RNA 提取試劑盒（DP440，天根生化，北京）；SETDB1 抗體（CST，美國），qRT-PCR 儀（ABI7500，美國）。 SETDB1 及內參引物均由上海生工生物公司合成；SETDB1上游引物：5′-TCCTGTGAAGCCTGAAGGAC-3′，下游引物：5′-TTAGTTGATGGCAGGCACAC-3′；內 參GAPDH 上游引物：5′-AAAATCAAGTGGGGCGATGC-3′，下游引物：5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

1.3 Q-PCR 檢測

按照試劑盒說明書提取總的RNA，并檢測其濃度和純度，RNA 純度A260/A280在1.8～2.1 之間視為合格。逆轉錄條件：50℃，30 min；94℃，2 min；循環次數1；RT-PCR 反應：94℃，15 s；60℃，30 s；68℃，3 min；循環次數40。每個樣本重復3 個副孔。采用2-ΔΔCt法 計算SETDBI 的相對表達量。DAB 顯色；蘇木素復染，梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Image-Pro Plus 6 軟件分析每張照片中腸上皮細胞SETDBl 的平均光密度值，取5 張照片的平均值作為該病例腸上皮細胞中SETDB1 的平均光密度值。

1.4 Western Blotting

提取組織總蛋白和蛋白濃度的測定。按照BCA 蛋白測定試劑盒說明進行濃度檢測，分裝后保存于-80℃冰箱備用。按照所測蛋白濃度，計算含20 μg 蛋白的體積即為上樣量，100℃加熱3～5 min 后，煮完后即可上樣；80 V 等壓電泳30 min 后轉為120 V 繼續電泳1～2 h 至溴酚蘭到達分離膠的底部；電泳結束后，小心取出膠放入電轉緩沖液中平衡20 min；TBST 洗3 次×5 min；加入二抗（1∶1 000 緩沖封閉液稀釋），搖床上室溫振蕩孵育1.5 h；TBST 洗3 次×5 min；化學發光、顯影。結果分析：膠片用EPSON 掃描儀掃描，FluorchemTM 8900 圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內參照GAPDH 條帶的含量，求其比值進行統計分析。

1.6 統計學分析

SPSS 16.0 軟件進行統計學分析；計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；用非參數相關的Spearman 秩相關系數（r）評估兩個變量之間的相關性；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SETDB1 的mRNA 及蛋白的表達結果

SETDB1的mRNA 在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量分別為：（2.54±1.33）、（2.88±1.25），均低于正常對照組（3.74±1.88），差異有統計學意義（P＜0.05）；SETDB1 的蛋白在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量分別為：（0.37±0.03）、（0.37±0.05），均低于正常對照組（0.69±0.08），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 SETDB1 的免疫組化表達結果

SETDBI 在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量的IOD 評分分別為：（18±5.1）×103、（37.7±12.5）×103，均明顯低于正常對照組（85.8±11.2）×103，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 SETDB1 的表達與IBD 患者疾病活動度的相關性分析

CD 及UC 患者腸黏膜組織中SETDB1 的表達與其疾病活動度評估指標CDAI 及Mayo 評分具有一定的相關性。見圖3。

3 討論

IBD 是一種腸道慢性炎癥性疾病，其發病機制尚不清楚。多數研究認為，其發病原因與腸道自身免疫系統、感染因素、環境因素、遺傳因素等均有一定的相關性［10-11］。其中，免疫失衡及腸道黏膜屏障功能障礙是IBD 發病的核心環節。因此，維持機體的免疫平衡［12］及腸道黏膜的屏障功能完整［13］是IBD 治療的關鍵所在。流行病學研究顯示：IBD 的發病率在西方國家逐漸趨于穩定，但是在發展中國家仍呈逐年增高的趨勢［14］，已成為消化專業研究的熱點和難點之一［15］。因此，進一步闡明研究IBD 發病相關機制，是一項十分重要且亟待解決的任務，具有重要的臨床價值及意義。

SETDB1，也稱為ESET 或KMT1E，是一種含有SET 結構域的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（HMT），屬于Suvar3-9 家族，可以通過三甲基化H3K9 調控基因的轉錄過程。SETDBl 蛋白早期發現是Huntington 病治療的靶點［16］。近年來的研究發現，SETDBl 蛋白的異常表達與多種腫瘤的發生發展存在著十分密切的關系。胰腺導管腺癌中，SETDB1 通過調節p53 的表達來抑制細胞凋亡［17］；SETDB1 可通過驅動結直腸癌細胞從G0/G1 期進入S 期從而促進癌細胞的增殖［18］；在非小細胞癌中，超氧化物歧化酶1（SOD1）通過miR-409-3p/SOD1/SETDB1 表觀遺傳調控前饋環促進癌細胞的增殖和轉移［19］。SETDB1 在IBD 發病中的作用目前研究較少，僅有個別研究顯示：小鼠腸道上皮細胞SETDB1 的缺失與腸道上皮細胞分化，屏障破壞，炎癥和死亡有關，SETDB1 在維持腸上皮屏障穩態中可能發揮著重要作用［6］。

本研究提示SETDB1 可能在IBD 的發病中扮演著重要角色，為IBD 發病機制的相關研究提供了新的方向和靶點。但SETDB1 在IBD 發病中的具體作用機制尚需進一步的研究。中山大學附屬郭建平教授團隊研究發現SETDB1 介導的AKT 的甲基化與PI3K 介導的AKT 的磷酸化相互作用，SETDB1 與PI3K協同調控AKT的活化［20］。mTORC1 是PI3K/AKT 信號通路下游的主要靶基因，且mTOR 抑制劑他克莫司在UC 誘導緩解和維持治療方面均具有顯著的治療效果［21］。上述研究提示，SETDB1 可能通過PI3K/AKT-mTOR 通路在IBD 的發生發展中發揮著重要作用，但具體作用機制仍需進一步探究。