miR-34、VEGF-C及sIL-2R檢測在乳腺癌淋巴結轉移中的預測

何姍姍 駱建美 劉賢 宋旭彤

乳腺癌為女性惡性腫瘤的發病之首，死亡率極高［1］。據相關資料顯示，我國乳腺癌的發病率逐年升高，且以每年3%～4%的增長速度不斷增加，因乳腺癌早期診斷率較低，大多數患者預后不理想［2］。既往文獻報道，乳腺癌的發生、發展過程中由多種蛋白共同參與，對乳腺癌發生的機制、診斷及治療進行深入研究，對改善患者預后，延長生存期有重要意義［3］。miRNA 可阻遏靶基因的翻譯，血清微小RNA34（microRNA34，miR34）是miRNA 中一類高度保守的抑癌基因，能抑制靶基因表達［4］。血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是腫瘤生成過程中特異性最高的促血管生長因子，可促進腫瘤細胞生長、增殖［5］。可溶性白細胞介素-2 受體（Solubleinterleukin-2receptor，sIL-2R）是腫瘤壞死因子細胞網絡中的重要組成部分，在抗病毒和抗腫瘤免疫方面發揮著重要的作用［6］。國內外文獻關于miRNA、VEGF-C 及sIL-2R與乳腺癌淋巴結轉移的關系研究較少。本研究通過檢測乳腺癌患者血清miRNA、VEGF-C 及sIL-2R水平，分析聯合三者檢測對乳腺癌淋巴結轉移的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2019年3月在本院就診的97 例乳腺癌患者，根據有無淋巴結轉移分為：淋巴結轉移組40 例、無淋巴結轉移組57 例。納入標準：①所有患者均經病理組織活檢并確診為乳腺癌［7］；②納入研究前未服用過影響激素水平的藥物；③無其他惡性腫瘤病史；④均簽署知情同意書。排除標準：①合并嚴重免疫力缺陷者；②合并嚴重精神類疾病，無法正常溝通者；③子宮內膜炎、盆腔子宮內膜異位癥及其他生殖系統疾病者；④一般資料不齊全者。選取同期在本院進體檢的97 例健康者作為對照組。3 組患者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過。

表1 3 組患者一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of 2 groups（±s）

表1 3 組患者一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of 2 groups（±s）

組別淋巴結轉移組無淋巴結轉移組對照組F/χ2值P 值n 40 57 97年齡（歲）53.37±4.35 53.45±4.39 53.22±4.11 0.060 0.946平均體重（kg）54.30±3.89 54.39±3.92 53.12±3.75 1.440 0.240病程（年）4.43±0.55 4.32±0.50 1.810 0.168乳腺癌家族史（有/無）5/35 7/50 8/89 0.893 0.640

1.2 方法

1.2.1 miR-34 檢測方法

采用實時熒光定量PCR 檢測各組中miR-34相對表達量。RNA 提取試劑Trizol 購自寶生物工程（大連）有限公司。RT-PCR 引物序列如下：miR-34 正 向 引 物 為5′-CAA TCG GGT ACT TGC TGG GCT TTC3′，反向引物為5′-GAG GGC CAT ACC TTA ACG CGT TAA TG3′。PCR 反 應 體 系共20 μL。其中，熒光混合物10 μL，10 μmol/L。正向引物和反向引物各1 μL，50×ROX 染料II 0.5 μL、cDNA 模板1 μL，雙蒸水6.5 μL。反應條件：95℃2 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，共40 個循環。miR-34 以U6 為內參基因。采用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.2 VEGF-C、sIL-2R 檢測方法

對照組于體檢當日，乳腺癌患者于入院后次日清晨8：00 空腹抽取肘靜脈血4 mL，其中2 mL 用含0.109 mol/L 枸櫞酸1∶9 抗凝，3 500 r/min 離心10 min 分離血漿。采用酶聯免疫吸附實驗檢測VEGF-C、sIL-2R，試劑盒由美國貝克曼庫爾特提供，檢測儀器為DXI800 美國貝克曼庫爾特全自動免疫分析儀。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗、多組間比較采用F檢驗；計數資料通過n（%）表示，采用χ2檢 驗；繪制ROC 曲 線，并 計 算ROC 曲線下面積（AUC），以分析miR-34、VEGF-C 及sIL-2R 檢測及三者聯合檢測對對乳腺癌患者淋巴結轉移的預測價值；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組之間miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較

3 組之間miR-34 水平比較：對照組＞無淋巴結轉移組＞淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0.05）；3 組之間VEGF-C、sIL-2R 水平比較：淋巴結轉移組＞無淋巴結轉移組＞對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組之間miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 2 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels among groups（±s）

表2 各組之間miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 2 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels among groups（±s）

組別淋巴結轉移組無淋巴結轉移組對照組F 值P 值n 40 57 97 miR-34 1.92±0.17 2.64±0.29 3.59±0.35 475.370＜0.001 VEGF-C（ng/L）534.45±49 .87 421.12±45.47 226.65±37.52 857.390＜0.001 sIL-2R（U/mL）765.32±59.65 512.14±47.14 325.48±40.69 1270.350＜0.001

2.2 不同病理特征組中miR-34、VEGF-C、sIL-2R水平比較

病理學分級為低、中分化的患者miR-34 低于高分化者，VEGF-C、sIL-2R 高于高分化者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者miR-34 高于Ⅲ～Ⅵ期者，VEGF-C、sIL-2R 低于Ⅲ～Ⅵ患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。有淋巴血管間隙浸潤的患者miR-34 低于無淋巴血管間隙浸潤者，VEGF-C、sIL-2R 高于無淋巴血管間隙浸潤者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同病理特征組中miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 3 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels in different pathological characteristics groups（±s）

表3 不同病理特征組中miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比較（±s）Table 3 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels in different pathological characteristics groups（±s）

臨床特征年齡腫瘤最大直徑（cm）腫瘤數目病理學分級TNM 分期淋巴血管間隙浸潤＜50≧50＜5≧5單發多發低、中分化高分化Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅵ期有無n 51 46 42 55 39 58 47 50 58 39 43 54 miR-34 3.10±0.35 2.99±0.33 3.11±0.31 3.05±0.27 3.12±0.37 2.98±0.34 2.89±0.31 3.55±0.38 3.48±0.37 2.94±0.33 2.68±0.35 3.39±0.41 t 值1.588 1.017 1.919 9.381 7.587 9.032 P 值0.116 0.312 0.058＜0.001＜0.001＜0.001 VEGF-C 407.25±30.14 410.12±30.25 388.35±39.65 395.32±40.12 396.32±41.13 401.21±41.33 551.32±50.36 412.12±41.55 421.36±40.46 537.65±48.63 539.27±42.15 433.12±35.65 t 值0.467 0.852 0.572 14.845 12.357 13.434 P 值0.641 0.396 0.568＜0.001＜0.001＜0.001 sIL-2R 554.65±69.46 551.32±69.10 534.69±70.33 530.14±51.36 514.65±53.45 517.37±63.89 752.12±71.23 503.36±59.12 516.78±62.35 733.64±68.98 741.23±71.14 523.45±61.25 t 值0.236 0.368 0.219 18.700 15.770 16.192 P 值0.814 0.714 0.827＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 聯合miR-34、VEGF-C、sIL-2R 檢測對乳腺癌淋巴結轉移的預測價值

miR-34、VEGF-C、sIL-2R 三者聯合檢測靈敏度、特異度分別為93.65%、94.23%，顯著高于單一檢測（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 聯合miR-34、VEGF-C、sIL-2R 檢測對乳腺癌淋巴結轉移的預測價值Table 4 predictive value of combined detection of miR-34，VEGF-C and sIL-2R in lymph node metastasis of breast cancer

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC Curve

3 討論

乳腺癌發生淋巴結轉移這一過程是由多基因及多種生化標志物共同參與的，由于腫瘤抑制基因、生化指標功能喪失，進而表現出細胞不受調控的增殖、分化和凋亡抑制等［8］。因此，臨床上致力于尋找更多高特異度的乳腺癌相關基因，以期通過多個指標聯合檢測為乳腺癌的診斷、病情評估、靶向治療及預后風險評估提供依據。

本研究中，三組之間miR-34 水平比較：對照組＞無淋巴結轉移組＞淋巴結轉移組；三組之間VEGFC、sIL-2R 水平比較：淋巴結轉移組＞無淋巴結轉移組＞對照組，與國外研究報道結果一致［9］。因此可以推測miR-34、VEGF-C 及sIL-2R 表達對乳腺癌淋巴結轉移等生物學行為有顯著的影響作用。miRNA 是一類高度保守的非編碼內源性RNA 分子，可通過結合于其下游靶基因3′端非編碼區，從而調控靶基因的轉錄，進而影響細胞的生物學行為［10］。VEGF-C 是腫瘤細胞生長過程中重要的血管內皮因子，特異性高，而乳腺癌淋巴結轉移依賴于血管生成［11］。sIL-2R 是機體重要的免疫調節物質，對于巨噬細胞的吞噬作用有明顯的刺激作用，一定程度上促進患者癌細胞轉移［12］。低表達的miR-34 會影響腫瘤細胞的增殖，并促進細胞凋亡，而高水平的VEGF-C 及sIL-2R 對乳腺癌淋巴結轉移有一定促進作用，對促進乳腺癌病情進展有顯著影響。

本研究還發現，病理學分級（低、中分化）、TNM（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴血管間隙浸潤的患者miR-34 表達量較低，VEGF-C、sIL-2R 水平較高，認為低表達量的miR-34、高水平的VEGF-C、sIL-2R 會推動病情進展，促進癌細胞淋巴結轉移，與Shah 等學者［13］研究結論一致。miR-34 是miRNA家族中有抑癌作用的一類基因，在結直腸癌、食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤中均呈異常低表達狀態，研究認為miR-34 異常低表達可作為惡性腫瘤診斷、病情評估、預后的標志［14］。VEGF-C 是一種由多種細胞分泌的糖蛋白，有較高的血管滲透性，為腫瘤細胞生長、增殖提供了有利條件［15］。sIL-2R 由多淋巴細胞合成，對腫瘤的發生、發展，與機體炎癥因關系密切。既往研究發現，sIL-2R 可作為免疫抑制劑，改善機體內分泌，通過抑制已活化的T 細胞克隆抑制機體免疫力，促進惡性腫瘤分化、增殖［16］。相關研究指出，結直腸癌患者中sIL-2R 表達水平較高，認為sIL-2R 對癌細胞的發生、發展、轉移均有一定預測作用［17］。

繪制ROC 曲線結果表明聯合miR-34、VEGFC、sIL-2R 檢測可用于預測乳腺癌患者淋巴結轉移情況。

綜上所述，miR-34、VEGF-C、sIL-2R 與乳腺癌淋巴結轉移情況有關，聯合三者檢測對評估乳腺癌病情、預測淋巴結轉移情況作用重大。