Cyclin D1、PSTAT3和OPN蛋白在胰腺導管腺癌中的表達及臨床意義

劉燕 張曼 李成龍

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocacinoma，PDAC）是一種主要來源于胰腺導管上皮的惡性腫瘤，惡性程度極高［1］。信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）家族的重要成員，其在Tyr705 位點被激活后可形 成PSTAT3（phosphorylated STAT3）［2］。研 究發現，活化的STAT3 能促使細胞發生惡性轉化，在裸鼠中形成腫瘤，因而STAT3被認為是一種癌基因［3］。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）是STAT3信號轉導途徑下游的一個靶基因，其異常表達可對細胞周期循環產生影響。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）作為一種轉移相關蛋白，在腫瘤發生及轉移中發揮重要作用。本研究檢測Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC患者中的表達情況，探討其在PDAC 中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年3月本院收治的75例PDAC 患者作為研究對象（PDAC 組）。其中男45 例，女30 例，平均年齡（49.19±2.14）歲，臨床分期：Ⅰ期23 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期13 例。組織病理學分級：高分化腺癌（Gl 級）23 例，中分化腺癌（G2 級）30 例，低分化腺癌（G3 級）22 例。納入標準：①所有患者有明確的病理學診斷依據，均確診為PDAC［4］；②入組前未接受放療及化療；③腫瘤直徑≤5 cm；④臨床資料完整無缺失；排除標準：①合并血液疾病者；②嚴重精神疾患或癡呆等無法配合本研究者；③存在除胰腺癌以外其他原發性惡性腫瘤者；④合并風濕免疫及結締組織病變者。另外取30 例來自切取供肝時附帶的正常胰腺組織及相應臨床資料作為對照組，男19 例，女11 例；平均年齡（48.26±2.01）歲；兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過，受試者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

收集所有患者臨床資料，比較Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 組織及正常胰腺組織中的表達；分析Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 患者各病理參數的相關性，記錄所有患者在隨訪時間內存活及死亡情況。

1.3 檢測方法

1.3.1 主要試劑

兔抗人多克隆抗體phospho-STAT3（Tyr705）為美國Upstate 公司產品，鼠抗人單抗Cyclin D1（DCS-6）購自丹麥的DAKO 公司，鼠抗人單抗OPN 為美國Santa Cruz 公司產品。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 結果判定［5］

判斷Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白陽性范圍的標準：每張切片在鏡下分別以低倍鏡及高倍鏡進行觀察，對每張切片上中下及里外中9 個位置觀察，根據Wachters 等的標準分析免疫組化。PSTAT3 陽性染色定位于細胞核上，Cyclin D1、OPN 陽性染色定位于胞漿和胞膜上。采用Volm雙評分法進行判定，在染色均勻的腫瘤區，選取5個高倍鏡視野（×400）：按陽性細胞百分率（A 值）評分：＜25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3分；按染色強度（B 值）評分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。綜合染色陽性細胞數與染色強度判斷結果：陰性（-）：0 分，弱陽性（+）：1～2 分，中度陽性（++）：3～4 分，強陽性（+++）：5～6 分；兩種計分的乘積為每例的加權分數，加權分數為0 為陰性，其余均為陽性。

1.4 隨訪方法

隨訪從患者術后開始，直至患者死亡或本研究的隨訪結束，為期3年，截止于2020年3月31日。患者的隨訪時間分布在10 至36 個月，平均隨訪時間為（29.67±3.11）個月。對患者隨訪的方式主要采用患者來院復查為主。總生存時間（Overall Survival，OS）表示患者從手術至死亡的時長。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料采用（）表示；采用多元Logistic 回歸分析影響PDAC 患者預后生存的危險因素，繪制Kaplan-Meier 生存曲線研究Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白對患者預后生存的影響；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 組織及正常胰腺組織中的表達

PDAC 組Cyclin D1、PSTAT3 和OPN蛋白陽性率高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 組織及正常胰腺組織中的表達比較［n（%）］Table 1 Expression comparison of cyclin D1，PSTAT3 and OPN proteins in PDAC tissues and normal pancreatic tissues［n（%）］

圖1 Cyclin D1、PSTAT3 及OPN 蛋白免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 Immunohistochemical staining of Cyclin D1，PSTAT3 and OPN protein（SP，×500）

2.2 不同臨床病理特征患者Cyclin D1、PSTAT3和OPN 蛋白的表達比較

臨床分期Ⅲ+Ⅳ、有淋巴轉移及神經浸潤的患者Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白陽性率表達顯著更高（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征患者Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白的表達比較［n（%）］Table 2 Expression of cyclin D1，PSTAT3 and OPN in patients with different clinicopathological features［n（%）］

2.3 影響PDAC 患者預后生存的危險因素

隨訪結果顯示，75 例患者3年生存率為13.33%（10/75）。神經浸潤、淋巴轉移、Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白陽性是影響PDAC 患者預后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

2.4 Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白對PDAC 患者預后生存的影響

Cyclin D1、PSTAT3 及OPN 蛋白陰性組平均生存時間均長于Cyclin D1、PSTAT3 及OPN 蛋白陽性組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白表達患者預后生存情況Figure 2 Prognosis and survival of patients with different expression of cyclin D1，PSTAT3 and OPN

3 討論

既往研究顯示，STAT3 在多種人類惡性腫瘤組織及細胞系中存在高表達，而在正常組織中表達比較微弱，提示STAT3 信號傳導途徑的激活在腫瘤的發生過程中起到重要的作用［6］。本研究結果顯示，PDAC 患者中PSTAT3 蛋白呈顯著陽性表達，且在臨床分期越高、出現淋巴結轉移及神經浸潤患者中陽性表達率更高，表明PSTAT3 蛋白可參與PDAC 的發生發展，這與黃陳等［7］研究中免疫組化發現PSTAT3 在胰腺癌組織中存在高表達，與臨床分期及淋巴結轉移有關相符合。

目前，CydinD1已被證實是STAT3 信號轉導途徑下游的一個靶基因［8］。諸多研究證實，CyclinD1 參與多種實體瘤形成的分子病理過程［9-10］。Kanayama 等［11］應用免疫組織化學的方法檢測顯示CycliID1 蛋白在胰腺癌細胞核中呈陽性表達，而其在正常組織中均為陰性表達，并且其表達情況與患者生存率有關。何勁松［12］等研究證實CydinD1在胰腺癌組織標本中呈過度表達。孟沙等［13］研究提出：當cyclin D1 過表達時，會使細胞失去對生長因子的依賴，產生大量的激酶復合體，誘導Rb 磷酸化，最終釋放轉錄因子E2F，導致細胞增殖加速，在此過程中則易引發細胞癌變。本研究中，CyclinD1 陽性染色定位于細胞的細胞核內，在癌組織中的陽性表達率顯著升高，與何勁松等研究數據趨勢一致，且本結果中CydinD1在病情嚴重患者中陽性表達率更高，其發展趨勢符合孟沙的研究理論。

OPN 廣泛分布于人體內多種組織和細胞中，是一種具有組織細胞特異性的的分泌型磷酸化糖蛋白。國外學者認為，OPN 在多種惡性腫瘤組織中高表達，其參與多種惡性腫瘤的發生發展、侵襲和轉移過程，并在一定程度上反映腫瘤細胞的惡性程度［14-15］。關于OPN 參與PDAC 侵襲轉移的具體機制目前尚未明確。本組關于OPN 蛋白在PDCA 及不同病理特征患者間中的表達符合國外學者提出的研究理論，且與唐雨等［16］研究中OPN 在胰腺癌組織中過表達的結果一致。本文經進一步Logistic 回歸分析及Keplan-meier 生存曲線分析，結果顯示：CydinD1、pTAT3 及OPN 蛋白陽性表達是影響患者預后生存的獨立危險因素，陽性表達患者生存時間均顯著縮短，提示三者可作為評估患者預后的指標。

綜上所述，Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白的高表達與PDAC 病情進展及預后有著密切關系，可作為預測患者預后生存的分子標志物和腫瘤治療的潛在的靶點。