木脂素-1通過抑制DNA拓撲異構酶I誘導胃癌細胞凋亡的機制研究

婁紅剛 張琛涵 康富貴 聶靜云 柴琛

據統計，我國新發胃癌病例占全球范圍內所有胃癌的44.10%左右［1］。DNA 拓撲異構酶I（Topoisomerase I，TopoI）在胃癌腫瘤細胞DNA 復制、轉錄中具有關鍵作用，抑制其活性是選擇性抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的重要靶點［2］。目前，羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）是唯一上市的以TopoI 為靶點的抗腫瘤藥物，在多種腫瘤治療中取得一定療效，但臨床實踐發現此類化合物存在藥物代謝效力低下、穩定性差異等局限性［3］。故亟需開發以TopoI 為靶點的非喜樹堿類藥物。木脂素屬于天然化合物，結構類型豐富，具有包含抗炎、抗病毒、抗腫瘤在內的廣泛生物活性［4］。本研究通過體外實驗探討Mzs-1 誘導SGC-7901 細胞凋亡、靶向抑制TopoI 的機制，為臨床開發、應用Mzs-1 作為治療胃癌候選藥物提供實驗依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

Mzs-1 有青島科技大學夏亞穆教授合成提供，人胃癌細胞株SGC-7901 購于上海生命科學研究院，由蘭州大學第一臨床醫學院中心實驗室凍存，DEME 培養基（高糖）購于Gibco 公司，PBS 購于Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）購于浙江天杭生物科技股份有限公司，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）購于北京索萊寶科技有限公司，雙抗（青/鏈霉素100×）、50×TAE 緩沖液、Meilunred 核酸電泳染料、羥基喜樹堿（HCPT）購于大連美侖生物技術有限公司，DMSO 購于Sigma 公司，CCK-8 購于上海翊圣生物科技有限公司，PBR322 質粒、DNA Topo I、DNA marker、6× Loading buffer 購于TaKaRa 公司，瓊脂糖購于HydraGene 公司，Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、PMSF 蛋白酶抑制劑購于上海碧云天生物技術有限公司，SDSPAGE 凝膠制備試劑盒、5×電泳緩沖液、10×轉膜緩沖液、10× TBST、RIPA 裂解液、5×蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司，甲醇購于天津市光復科技發展有限公司，脫脂奶粉購于Biofroxx 公司，蛋白標記物（marker）購于Thermo Scientific 公司，兔抗人Topo I 單克隆抗體購于Proteintech 公司，兔抗人β-actin 單克隆抗體購于愛必信生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 購于北京中杉金橋生物技術有限公司，ECL 化學發光液、聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）購于Biosharp 公司。

1.2 方法

Mzs-1 使用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，經濾膜孔徑0.45 μm，濾器抽濾除菌后，置于4℃冰箱中保存，各組DMSO 濃度均低于0.1%。將人胃癌細胞株SGC-7901 分裝于含有2 mL 原始培養基的25 cm2細胞培養瓶中，再加入完全培養基2 mL，放置在37℃、二氧化碳飽和濕度35%的細胞培養箱中進行培養，當細胞長滿培養瓶底面積80%～90%后，依次進行細胞傳代、細胞凍存、細胞復蘇及細胞計數處理。采用CCK-8 法檢測Mzs-1 對人胃癌細胞株SGC-7901 增殖抑制的影響，以酶標儀檢測450 nm 處吸光度（OD）值，OD值重復測量3 次，取平均值。細胞存活率（%）=（加藥組OD 值-空白組OD 值）/（陰性對照組OD 值-空白組OD 值）×100%，采用GraphPad Prism5 計算藥物半數抑制濃度（IC50）。采用流式細胞術檢測Mzs-1 對SGC-7901 細胞凋亡及細胞周期的影響，采用瓊脂糖凝膠電泳Mzs-1 對TopoI 活性的影響，采用蛋白印跡法檢測TopoI 蛋白表達量。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 22.0 進行統計學分析，計量資料以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用LSD-t 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；實驗數據使用GraphPad Prism5 軟件進行作圖及計算藥物IC50，以P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mzs-1 對SGC-7901 細胞的增殖抑制作用

Mzs-1 能明顯抑制SGC-7901 細胞增殖，且存在時間-濃度依賴性（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Mzs-1 對SGC-7901 細胞的增殖抑制作用Figure 1 The inhibitory effect of Mzs-1 on the proliferation of SGC-7901 cells

2.2 Mzs-1 對SGC-7901 細胞的誘導凋亡作用

不同濃度Mzs-1 處理SGC-7901 細胞48 h 后，各組早期凋亡細胞比率差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白對照組相比，不同濃度Mzs-1 處理SGC-7901 細胞48 h 后，隨著Mzs-1 濃度增加，早期凋亡細胞比率不斷升高，且呈現濃度依賴性（P＜0.05）。與HCPT 陽性對照組比較，Mzs-1 濃度為80 μg/mL 時早期凋亡率略高（P＞0.05）。見表1。

表1 Mzs-1 對SGC-7901 細胞早期凋亡率的影響（±s）Table 1 The effect of Mzs-1 on the early apoptosis rate of SGC-7901 cells（±s）

表1 Mzs-1 對SGC-7901 細胞早期凋亡率的影響（±s）Table 1 The effect of Mzs-1 on the early apoptosis rate of SGC-7901 cells（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05。

藥物空白對照組Mzs-1 HCPT 陽性對照組F 值P 值n 3 3 3藥物濃度（μg/mL）0 10 20 40 80 10 1198.004＜0.001早期凋亡率（%）1.10±0.18 2.23±0.08a 10.60±0.20a 11.90±0.20a 18.37±0.57a 18.19±0.63

2.3 Mzs-1 對SGC-7901 細胞周期的影響

不同濃度Mzs-1 作用于SGC-7901 細胞48 h后，各組處于G2/M 期細胞比例差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白對照組相比，相同時間內，隨著Mzs-1 藥物濃度增加，處于G2/M 期細胞比例明顯增加（P＜0.05）；與HCPT 陽性對照組相比，Mzs-1濃度為80 μg/mL 時G2/M 期細胞比例略高（P＞0.05）。見圖2、表2。

圖2 Mzs-1 對SGC-7901 細胞周期變化的影響Figure 2 The effect of Mzs-1 on SGC-7901 cell cycle changes

表2 Mzs-1 對SGC-7901G2/M 期細胞比例的影響（±s）Table 2 The effect of mzs-1 on the proportion of SGC-7901 cells in G2/M phase（±s）

表2 Mzs-1 對SGC-7901G2/M 期細胞比例的影響（±s）Table 2 The effect of mzs-1 on the proportion of SGC-7901 cells in G2/M phase（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

藥物空白對照組Mzs-1 HCPT 陽性對照組F 值P 值n 3 3 3藥物濃度（μg/mL）0 10 20 40 80 10 1508.620＜0.001 G2/M 期（%）8.30±2.19 11.58±0.93a 13.67±1.07a 15.56±0.83a 46.74±0.40a 46.60±0.65

2.4 Mzs-1 對DNA TopoI 活性的影響

與只加入pBR322 DNA 泳道相比，加入TopoI的超螺旋pBR322 DNA 被解旋為松弛型DNA；HCPT 陽性對照組在濃度為10 μg/mL 時完全抑制TopoI 對pBR322 DNA 的解旋作用；加入Mzs-1 的泳道隨著藥物濃度增加，超螺旋DNA（SC）增多，Mzs-1 濃度為40 μg/mL 時，完全抑制TopoI 活性，與HCPT 對照組趨勢一致。見圖3。

圖3 Mzs-1 對DNA TopoI 活性的影響Figure 3 The effect of Mzs-1 on DNA TopoI activity

2.5 Mzs-1對SGC-7901細胞TopoI蛋白表達的影響

Mzs-1 處 理SGC-7901 細胞48 h 后，各組TopoI 蛋白相對表達量差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白對照組相比，隨Mzs-1 藥物濃度增加，TopoI 蛋白表達量逐漸下降（P＜0.05），且Mzs-1濃度為80 μg/mL 時抑制率略低于HCPT 陽性對照組。見表3。

表3 Mzs-1 對SGC-7901 細胞中TopoI 蛋白相對表達量的影響（±s，n=3）Table 3 The effect of Mzs-1 on the relative expression of TopoI protein in SGC-7901 cells（±s，n=3）

表3 Mzs-1 對SGC-7901 細胞中TopoI 蛋白相對表達量的影響（±s，n=3）Table 3 The effect of Mzs-1 on the relative expression of TopoI protein in SGC-7901 cells（±s，n=3）

注：與對照組相比，aP＜0.05。

藥物空白對照組Mzs-1 HCPT 陽性對照組F 值P 值藥物濃度(μg/mL)0 10 20 40 80 10 51.762＜0.001灰度值比(TopoI/β-actin)1.10±0.07 0.88±0.12a 0.71±0.10a 0.48±0.04a 0.37±0.05a 0..24±0.06

3 討論

胃癌是國內最常見消化道惡性腫瘤之一，發病率、死亡率僅次于肺癌，總體預后仍處于較低水平［5］。胃癌早期無明顯癥狀，多數患者就診時已處于進展期甚至晚期，喪失手術根治時機，放化療成為主要治療手段，可殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞擴散，延長生存時間，但毒副反應較多，嚴重降低患者生存質量［6］。

中醫藥療法在減輕臨床癥狀、抑制轉移、減少復發等抗腫瘤治療中卓有成就。牛蒡屬于菊科牛蒡屬植物，其果實可入藥，稱為牛蒡子，木脂素類化合物是其主要活性成分，具有調節免疫、保肝、抗病毒、抗炎等作用［7］。同時，大量國內外報道證實，木脂素具有良好抗腫瘤作用，此類化合物可經由眾多途徑抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡［8-9］。而細胞增殖與凋亡失衡是胃癌的基本病理機制［10］。Mzs-1 是以牛蒡子活性成分衍生物為基礎合成的一種新型木脂素類化合物，屬于木脂素類的合成前體。本研究結果提示Mzs-1 可能通過阻滯SGC-7901 細胞，使其停滯于G2/M 期，從而誘導細胞凋亡，最終抑制人胃癌細胞株SGC-7901 增殖。因此，探究Mzs-1 在胃癌中的抗腫瘤作用機制、開發高效的藥用Mzs-1 具有重要意義。

Topo 可直接影響或參與細胞DNA 復制、轉錄等過程，其中TopoI 對單鏈DNA 作用，每次僅作用于一條鏈，能夠催化DNA 鏈斷裂和重新連接，無需能量輔助因子，可直接發揮相關作用［11］。TopoI 具有增殖依賴性，在非循環增殖細胞與循環增殖細胞中無差異，研究顯示，TopoI 雖無腫瘤特殊性，但與正常組織相比，在腫瘤細胞中的表達量顯著升高［12］。故抑制TopoI 活性成為臨床公認抗腫瘤藥物的作用靶點。目前，HCPT 是臨床應用較為廣泛的化療藥物，其主要作用機制便是經由抑制TopoI 活性誘導腫瘤細胞凋亡，已投入到胃癌的治療中。但臨床證實，HCPT 因其自身耐藥性、穩定性、患者個體差異性等因素導致療效受限［13］。本研究采用瓊脂糖凝膠電泳法測定Mzs-1 對TopoI 活性的影響，發現隨著Mzs-1 濃度增加，TopoI 活性逐漸下降直至失活。由此可知，Mzs-1 能夠抑制TopoI 活性，其作用機制可能在于以下兩個方面：一方面Mzs-1 可能通過直接抑制TopoI 催化活性導致其失活，另一方面Mzs-1 可能是經由干擾TopoI 與DNA 結合，促使TopoI、DNA、藥物形成三元復合物，從而阻滯DNA 復制，誘導腫瘤細胞死亡。

為進一步探究Mzs-1 抗腫瘤活性及相關機制，本研究結果發現TopoI 蛋白表達量隨Mzs-1 濃度增加呈不斷降低趨勢。說明Mzs-1 能靶向抑制TopoI 蛋白表達。此外，體內、體外實驗均表明，TopoI 抑制劑的抗腫瘤作用主要與誘導腫瘤細胞凋亡有關，多數涉及線粒體依賴途徑，即經由Caspase 家族介導的凋亡途徑發揮相關藥物作用，作用機制與激活、上調Caspase-3 相關［14-15］。有文獻指出，采用Mzs-1 處理SGC-7901 細胞株后，Caspase-3 表達呈上調趨勢［16］。提示Mzs-1 靶向抑制TopoI 表達的作用可能是依賴于Caspase-3 的酶聯反應而啟動細胞凋亡程序。且與HCPT 相比，Mzs-1 具有可人工合成、成本較低等優勢，為臨床治療胃癌提供新思路。

綜上可知，Mzs-1 能抑制人胃癌細胞株SGC-7901 增殖，誘導SGC-7901 細胞凋亡，機制可能與Mzs-1 抑制SGC-7901 細胞內TopoI 活性及蛋白表達有關。但Mzs-1 對其他惡性腫瘤細胞的抑制增殖、誘導凋亡作用仍需進一步探索。