二代測序在Meckel綜合征植入前遺傳學檢測的應用

何天文 區惠紅 盧建 陳創奇 劉頓 丁紅珂 劉玲 杜麗 尹愛華★

Meckel 綜合征（meckel syndrome，MS）是由德國解剖學家Meckel 等在1822年首次報道的一種罕見的致死性常染色體隱性遺傳病，臨床上以枕部腦膨出、嚴重的多囊腎和軸后多指（趾）畸形等為主要特征［1-2］。Meckel 綜合征預后差，胎兒常發生宮內死亡，出生的胎兒大多僅能存活數天至數周，且目前還無根治的方法，植入前遺傳學檢測和產前診斷是預防Meckel 綜合征患兒出生的有效方法。近年來，二代測序（next generation sequencing，NGS）技術飛速發展，已經成為胚胎植入前遺傳學檢測（preimplataion genetic testing，PGT）的主要檢測手段之一［3］。NGS 能檢測染色體非整倍性、染色體結構異常和單基因遺傳病，準確性好且精度高［4-5］。本研究運用NGS 對胚胎MKS1基因突變直接測序和構建胚胎單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）單倍型進行PGT，以期避免妊娠Meckel 綜合征和非整倍體胎兒。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

男方（Ⅱ：1），35 歲，表型正常，既往體健。男方父母（Ⅰ：1 和Ⅰ：2）表型正常，既往體健。女方（Ⅱ：2），34 歲，表型正常，既往體健，懷孕2 次，生產0 次，流產2 次，2014年孕25 周時超聲發現羊水過少行引產術，未進一步進行相關基因檢測；2016年孕19 周時超聲提示胎兒（Ⅲ：1）枕骨缺如、腦膨出、心包積液、三尖瓣反流、肝回聲增粗、雙側多囊腎、左側脛骨骨折、雙足軸前多趾等多種畸形，在外院行引產術，外院芯片捕獲高通量測序結果顯示胎兒MKS1基因c.472C＞T 純合突變，該突變在數據庫中有疾病相關性報道［6］。女方父母（Ⅰ∶3 和Ⅰ∶4）表型正常，既往體?。▓D1）。為了再次避免妊娠患兒，該夫婦于2017年5月在廣東省婦幼保健院就診咨詢要求行PGT。該夫婦充分了解PGT 過程及相關風險后，簽署知情同意書接受PGT。本研究經廣東省婦幼保健院生殖醫學倫理委員會批準。

圖1 Meckel 綜合征家系圖Figure 1 Pedigree of Meckel syndrome

1.2 主要試劑與儀器

磁珠法血液基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司），微量樣本全基因組擴增（MDA 法）試劑盒（北京中儀康衛醫療器械有限公司），胚胎植入前單基因病檢測建庫試劑盒（北京中儀康衛醫療器械有限公司），測序反應通用試劑盒、胚胎植入前單基因病檢測標簽接頭試劑盒（北京中儀康衛醫療器械有限公司），胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（北京中儀康衛醫療器械有限公司），QUBIT 1X 雙鏈DNA 高靈敏度分析試劑盒（北京中儀康衛醫療器械有限公司），核酸定量計Qubit Fluorometer（Invitrogen 公司，美國），verity 梯度PCR 儀、ABI3730 測序儀（ABI 公司，美國），MiSeq 高通量測序儀（Illumina 公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及基因組DNA 提取

分別抽取夫婦（Ⅱ：1 和Ⅱ：2）及雙方父母（Ⅰ：1、Ⅰ：2、Ⅰ：3 和Ⅰ：4）外周血各2 mL，EDTA 抗凝。Ⅱ：2 孕18～24 周時在超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取胎兒羊水5～10 mL。磁珠法血液基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA，Qiamp DNA Blood Mini Kit 提取試劑盒提取羊水基因組DNA，均按試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 Sanger 測序調查家系成員MKS1基因突變情況

用Oligo6 設計針對MKS1基因c.472C＞T 突變位點的特異性PCR擴增引物（F：5′-TCTACCAAGCACACTAACCC-3′，R：5′-TCCCTCTCTCTGAGGCAC-3′，擴增片段位于chr17：56291905-56292495，擴增片段長度為591 bp），PCR 擴增產物用ABI3730 遺傳分析儀進行序列測定。用SeqMan軟件對ABI3730 遺傳分析儀生成的ab1 測序結果文件進行分析，調查家系成員攜帶MKS1基因c.472C＞T 突變情況。

1.3.3 家系成員單倍型的構建

以MKS1基因（NM_017777.3 chr17：56282797-56296966）反向轉錄編碼區為目標，在該基因上下游2 M 區域內（chr17：54576882-58218653）選擇200 個SNP 位點作為遺傳連鎖標記，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER 網站設計多重PCR 引物，對提取的家系成員的基因組DNA 進行多重PCR，多重PCR 產物經純化和建庫后行NGS，選擇有效SNP 位點進行構建家系成員的SNP 單倍型進行連鎖分析，確定攜帶MKS1基因c.472C＞T 突變的風險染色體。

1.3.4 胚胎活檢

根據常規體外培養方法［6］，首先采用卵細胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）方式進行授精，待胚胎培養至第5/6 天，活檢囊胚滋養層細胞2～9 個進行遺傳學檢測。

1.3.5 植入前遺傳學檢測

對活檢獲得的滋養層細胞進行基于等溫多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）技術的全基因組擴增（Whole genome amplification，WGA）。利用WGA 產物通過多重PCR 擴增胚胎MKS1基因編碼區和高密度緊密連鎖的SNP 位點，多重PCR 產物經純化和建庫后進行NGS。通過NGS 對胚胎MKS1基因突變位點直接測序和構建胚胎SNP 位點單倍型連鎖分析。通過Sanger 測序檢測MKS1基因c.472C＞T 突變驗證二代測序結果。針對正常和雜合攜帶致病突變的胚胎進行了低深度的染色體非整倍性篩查，以排除有攜帶染色體拷貝數異常的胚胎。

1.3.6 產前診斷

于孕18～24 周時行羊膜腔穿刺進行胎兒染色體核型G 顯帶分析和Sanger 測序檢測胎兒MKS1基因c.472C＞T 突變，驗證PGT 結果。

2 結果

2.1 家系成員攜帶MKS1 基因c.472C＞T 突變情況

通過Sanger 測序分析，發現該家系成員中男方（Ⅱ：1）、女方（Ⅱ：2）、男方父親（Ⅰ：1）和女方母親（Ⅰ：4）攜帶MKS1基因c.472C＞T 的致病性突變（圖2）。引產胎兒（Ⅲ：1）外院結果顯示MKS1基因c.472C＞T 純合突變，分別遺傳自父親和母親（圖1）。

圖2 MKS1 基因c.472C＞T 突變Sanger 測序圖Figure 2 Sanger sequencing of c.472C ＞T mutation in MKS1 gene

2.2 家系成員SNP 單倍型構建

經過多重PCR 和NGS 后，選擇了74 個有效SNP 位點成功構建家系成員SNP 單倍型，成功確定夫婦的攜帶MKS1基因c.472C＞T 突變的風險染色體。見表1、圖3。

表1 夫婦有效SNP 位點數和分布Table 1 Number and distribution of effective SNPs in couples

2.3 植入前遺傳學檢測

第6 天活檢6 個囊胚滋養層細胞分別標記為D601、D602、D603、D604、D605 和D606。胚胎 的MKS1基因c.472C＞T 突變的NGS 結果、SNP 單倍型連鎖分析結果和Sanger 測序結果提示6 個胚胎中D601、D602 和D603 為未檢測到突變胚胎，D605 和D606 為雜合攜帶胚胎，D604為致病胚胎。D601、D602、D603、D605 和D606低深度的染色體非整倍體篩查結果顯示D601為非平衡的整倍體胚胎，其它為平衡的整倍體。見圖4、表2。

圖4 胚胎SNP 單倍型分析結果Figure 4 SNP haplotype analysis results of embryos

表2 胚胎MKS1基因c.472C＞T突變植入前遺傳學檢測結果Table 2 PGT results of c.472C＞T mutation in MKS1 gene

2.4 產前診斷

選擇正常且發育良好的整倍體胚胎（D602）進行移植，孕19 周經羊膜腔穿刺產前診斷結果顯示胎兒染色體核型G 顯帶分析未發現異常，Sanger測序未檢測到胎兒MKS1基因c.472C＞T 突變，與PGT 結果一致，見圖5。孕38 周順產分娩一正常嬰兒，體重2 690 g，健康狀況良好。

圖5 胎兒MKS1 基因c.472C＞T 突變的Sanger 測序圖Figure 5 Sanger sequencing map of c.472C＞T mutation in fetal MKS1 gene

3 討論

Meckel 綜合征是一種致死性常染色體隱性遺傳?。?］，發病率各國報道不一，以芬蘭最高，約1/9 000 活產嬰［8］，我國僅見散發病例報道［9-10］。Meckel 綜合征的臨床表現比較一致，但是具有遺傳異質性［11］。與Meekel 綜合征相關的基因有多個，按基因定位發現的時間順序分別稱之為Meckel 綜合征1～6 基因。2006年Kytt?l? 等［12］利用基因克隆技術確定了MKS1基因定位于17q23，基因長13 869 bp，包含18 個外顯子。本研究家系中引產胎兒為MKS1基因c.472C＞T 純合突變導致的Meckel 綜合征，通過PGT 治療后該夫婦分娩一正常嬰兒，也再次驗證了MKS1基因c.472C＞T 突變的致病性。

日前，Meckel 綜合征尚無有效的根治方法，植入前遺傳學檢測和產前診斷是預防Meckel 綜合征患兒出生的主要手段。絨毛活檢、羊水穿刺、臍帶血穿刺傳統的介入性產前診斷術具有創性，還具有一定流產風險［13］。Meckel 綜合征攜帶者夫婦經產前診斷后確診胎兒為Meckel 綜合征后，需要選擇終止妊娠，給孕婦帶來一定的身體傷害和心理負擔。對Meckel 綜合征攜帶者夫婦進行胚胎植入前遺傳學檢測，在胚胎植入前進行遺傳學分析后選擇正常胚胎進行移植，可以避免異常胚胎妊娠的發生，阻斷Meckel 綜合征在家系中的再發風險。胚胎植入前遺傳學檢測將遺傳病的預防提前到胚胎階段，與傳統的產前診斷相比具有明顯的優勢，可以避免可能的治療性引產給母體帶來身體和心理的創傷［6］。

隨著基于MDA 技術的WGA 技術的發明，該技術克服了單細胞水平基因檢測DNA 模板量過少的問題，極大地提高了檢測結果的準確性和可靠性，但是WGA 有擴增不均勻和等位基因脫扣（allele drop-out，ADO）的風險［14］。NGS 技術的發明，實現了一次性對上百萬條DNA 進行測序，不僅縮短了耗費時間，也將單堿基測序成本降至了最低，遺傳性疾病的診斷率和分辨率邁入新的高度，給PGT 技術帶來了革命性的改變［6］。NGS 具有高通量、高并行性和高分辨率等特性，二代測序技術可以提供高深度的多位點多基因分析，結合SNP 單倍型連鎖分析，可以避免由ADO 帶來的檢測錯誤［15］。NGS 已經成為PGT 的主要的檢測手段，其不但能檢測染色體非整倍性、染色體結構異常和單基因遺傳病，而且準確性好和精度高，與如熒光原位雜交和比較基因組雜交等傳統的PGT 技術相比具有明顯的優勢。

本研究成功應用二代測序技術對遺傳性Meckel 綜合征家系進行植入前遺傳學檢測，可以阻斷該單基因病在該家系中的再發風險，還可以避免選擇非整倍體胚胎而導致的流產問題，是Meckel 綜合征出生缺陷的有效預防手段。