杜氏肌營養不良基因突變檢測國家參考品的研制

于婷 孫楠 孫晶 黃杰 曲守方

杜氏肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由肌營養不良蛋白（dystrophin）基因突變所致的X-連鎖隱性遺傳病，是一種嚴重的、致死性神經肌肉疾病［1-3］。DMD患者多在20 多歲死于呼吸衰竭或心力衰竭［4］，迄今為止尚無治愈的方法。因此，對DMD患者及攜帶者行基因診斷，以及高風險胎兒行產前診斷［5］，顯得格外重要。目前DMD基因突變檢測試劑盒均未取得醫療器械注冊證，多在第三方檢測機構使用或者僅用于科研。多家公司正在開展DMD檢測試劑盒醫療器械注冊證的申報，以便合法合規進入醫院。建立DMD基因突變檢測國家參考品可為這類試劑盒性能評價提供客觀有效的評價手段。2019 起中國食品藥品檢定研究院（下稱本院）開展了DMD基因突變檢測國家參考品的研制工作。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

外周血樣來自中山大學附屬第一醫院、武漢康圣達醫學檢驗所、廣州市婦女兒童醫療中心。本研究的臨床基本信息收集和臨床血樣的采集均獲得了醫院倫理委員會批準，以及患兒或家屬的知情同意，簽署了知情同意書。

1.2 試劑

多重連接依賴性探針擴增技術（MLPA）檢測試劑盒（蘇州貝康），SALSA MLPA 檢測試劑（MRCHolland）；二代測序法（next generation sequencing，NGS）檢測試劑盒：①半導體測序法：蘇州貝康、東莞博奧木華；②可逆末端終止測序法：北京貝瑞和康、邁基諾、亞能（深圳）、歐蒙未一；③靶向測序法：成都納海；④聯合探針錨定聚合測序法：天津華大。

1.3 檢測儀器

ABI 3730XL、ABI SeqStudio 及ABI 3730X 基因分析儀（賽默飛）；DA8600 Ion Proton 高通量測序儀（達安基因），NovaSeq 6000 基因測序儀及Miseq 基因測序儀（美國，Illumina 公司），BioelectronSeq 4000 基因測序儀（博奧生物），MGISEQ-2000 PE100 基因測序儀（華大智造）。

1.4 方法

1.4.1 樣本篩選及采集

根據國內外文獻報道的常見DMD突變，作為參考品備選范圍，采集DMD患兒及其家系外周血（不少于10 mL），-70℃以下保存。

1.4.2 國家參考品制備

采用外周血建立DMD基因突變的永生化細胞系后，進行擴增及DNA 提取，最終每份樣本每管稀釋至25 ng/μL 左右。

1.4.3 國家參考品驗證及均勻性、穩定性檢驗

8 個廠家采用了10 種檢測試劑對參考品進行DMD基因突變位點的驗證。本次驗證僅給出家系信息，不給出DMD基因突變的具體信息。各參加單位根據試劑說明書或者實驗室SOP 進行檢測。要求：①NGS 試劑按照各自聲稱的檢測限對樣本測定1 次即可；MLPA 試劑按照原濃度和檢測限濃度各測定1 次；②均勻性：NGS 試劑和MLPA 試劑各測定3 次；③穩定性：MLPA 試劑測定反復凍融3 次后的樣本。

2 結果

2.1 參考品組成

共建系成功46 份樣本，包含16 個家系及3 份獨立的患兒樣本。樣本DMD基因突變信息包括：外顯子缺失及重復，以及點突變或微小缺失，具體見2.2 驗證結果。

2.2 驗證結果

驗證結果見表1，MLPA 法試劑檢測結果一致，NGS 法試劑檢測的結果，大部分一致，部分結果存在差異。

表1 DMD 基因突變檢測候選參考品驗證結果匯總表Table 1 The summary of validation results for the candidate reference of detection of DMD

2.3 參考品均勻性及穩定性結果

均勻性實驗中，NGS 試劑和MLPA 試劑各自測定結果一致；穩定性實驗中，MLPA 試劑測定反復凍融3 次后的樣本，結果與正常保存樣本的結果一致。

3 討論

目前對DMD的分子診斷方法，主要可分為兩種類型，即對外顯子缺失和重復突變的檢測，以及微小突變的檢測。對于缺失和重復突變的檢測主 要 有多 重PCR［6］、比 較基因 組雜交 芯片［7］及MLPA［8-9］等。多重PCR 法多用于明確先證者的突變類型后，對家系其他成員進行已知突變位點的檢測；MLPA 作為一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定性和定量分析的技術，可檢測出DMD基因全部外顯子的缺失和重復突變，并能檢出攜帶者，應用最為廣泛，商品化的MLPA 正逐步取代多重定量PCR 等方法；NGS 技術除可檢測到缺失和重復外，可快速有效檢測點突變和微小突變［10-11］。當前對DMD的基因檢測策略普遍是先對患者進行MLPA 檢測，然后對未發現突變的患者進行基因組DNA 分析［12-15］。本次驗證過程中，即采用了上述的MLPA 法和NGS 法。

為評估DMD基因突變檢測試劑盒的分析性能，DMD國家參考品的原料選用臨床外周血，以保持與臨床樣本的一致性，并盡可能涵蓋多種突變類型。MLPA 試劑檢測結果一致，表明該方法成熟可靠。而NGS 結果不一致，主要原因如下：①選擇了不同的轉錄本：NM_000109 和NM_004006，所以突變位點信息表述不同，但結果一致；②某實驗室只檢SNV/Indel 變異，所以未報DMD 外顯子缺失或突變。在此基礎上，再對有爭議樣本的突變信息分析：①3 號樣本，僅2 家檢出NM_004006.2：c.412_413delAA。對該位點設計引物進行Sanger 測序驗證，確認該致病突變存在；②4、13、14、32、42、43 號樣本，多家亦有檢出其他突變位點，根據ACMG2015 指南判為VUS，無明確臨床意義，不報告該突變；③37 號樣本同時存在XO 情況，XX 部分為外顯子5-7 雜合重復，XO 部分為外顯子5-7 半合重復，并且XO 體細胞占比偏高導致了檢測信號為純合。因本參考品主要考察DMD基因突變情況，此處嵌合，不做評價，檢出外顯子5-7 重復即可；④當僅1 家與其他家結果不一致時，不采信該實驗室結果（如10、22、38 號樣本）。以上結果表明，檢測結果出現差異時，應重點考慮兩方面，一是當樣本存在嵌合時，由于測序深度及嵌合程度的影響，可能出現DMD基因突變無法檢出的情況；第二，對于突變是否具有致病意義的認識程度不同，未按照ACMG2015 指南進行突變的判斷，以致給出過多無臨床意義的突變信息。廠家對于檢測到的突變信息應進行預先識別確認，不應測到即報，否則不僅給臨床造成不便，而且對于患者及其家庭會造成一定的心里壓力。通過協作驗證，最終給出采用該參考品進行試劑盒質量評價的標準為：檢測范圍內的缺失、重復及突變位點均應檢出；試劑盒檢測范圍外的突變應為野生型或未檢出。因樣本為臨床樣本，給出的突變信息僅限于根據當前指南判為致病的突變信息。如在應用過程中有檢出的突變上升到致病等級，將在驗證之后，及時更新相關信息。通過均勻性和穩定性研究，該參考品均滿足要求，且應用性良好，可以作為國家參考品應用。今后還將對該候選參考品進行期間核查及長期穩定性研究。

目前已發現DMD致病突變位點類型達上百種，然而多數突變所致的發病率并不高，因此要想制備包括DMD全部突變的大panel 并不現實。這套國家參考品突變位點包含了主要的缺失突變、重復突變和微缺失突變三種類型，基本可以滿足評價DMD檢測試劑盒性能的要求，并且將在今后根據需要逐步擴充新的DMD突變基因突變位點。