丙氨瑞林的合成

李宜航

(常德職業技術學院，湖南 常德 415000)

丙氨瑞林為一種人工合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)的九肽類似物，主要應用于治療子宮內膜異位癥。臨床研究表明[1]該藥用藥初期可刺激垂體釋放促卵泡素(FSH) 和促黃體生成素(LH)，引起卵巢源性甾體激素短暫升高；重復用藥可抑制垂體釋放LH和FSH，使血中的雌二醇水平下降，達到藥物去卵巢的作用，這種抑制作用可用于治療子宮內膜異位癥等激素依賴性疾病。丙氨瑞林具有較高的藥用價值和應用市場。

圖1 丙氨瑞林合成路線Fig.1 Synthetic route of alarelin

目前丙氨瑞林的制備方法主要是以哌啶為脫帽試劑的多肽固相合成法[2]，主要存在制備方法成本相對較高，并且不方便運輸和儲存的缺點。本研究采用以哌嗪作為脫帽試劑用CTC樹脂合成片段，結合液相法合成丙氨瑞林，哌嗪不是易制毒試劑，成本比經典合成法用的易制毒試劑哌啶要低，并且更方便運輸和儲存，此外，CTC樹脂合成片段還以方便自動化生產[3-4]；CTC樹脂可以回收重復利用；適合大規模工業化生產，沒有劇烈的化學反應；降低了生產成本。合成工藝流程如下圖所示：

1 儀器與試劑

Agilent technologies 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli--Q超純水系統，德國默克密理博公司；R-100型旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；GL-150干式恒溫器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；旋渦混合器 XW-80A，上海精科實業有限公司。

2-氯三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂，替代度為1.0 mmol·g-1)，天津南開合成科技有限公司；所有氨基酸均采購自吉爾生化(上海)有限公司；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、二異丙基乙胺(DIEA)均采購自蘇州昊帆生物股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)、二乙胺、石油醚均為分析純。

2 方法與結果

2.1 Leu-CTC 樹脂的制備

稱取25 g(25 mmol)CTC樹脂于250 mL固相合成反應器中，取8.835 g(25 mmol)Fmoc-Leu-OH于250 mL三角瓶中，100 mL量筒量取DCM 120 mL，搖勻，加DIEA 41 mL(250 mmol)，搖勻溶解，倒入反應器開始反應。反應1 h時，用抽濾裝置抽去反應液，用DMF洗4次；量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應器中，反應20 min，然后抽去反應液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色。

2.2 Boc-Pglu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-樹脂的合成

得到Leu-樹脂后，向反應體系中添加第二氨基酸保護單體Fmoc-D-Ala-OH 15.567 g(50 mmol)、縮合劑HBTU 18.962 g(50 mmol)和堿DIEA 9.916 mL(60 mmol)，溶劑為DMF，反應時間為2小時，反應完成后，用DMF洗滌4遍，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈無色，既反應完全。得到Fmoc-D-Ala-Leu-樹脂后，量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應器中，反應20 min，抽去反應液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色，既獲得D-Ala-Leu-樹脂。在獲得D-Ala-Leu-樹脂后，按照上述縮合反應方法，依次在D-Ala-Leu-樹脂上連接氨基酸保護單體：Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OHFmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pglu-OH后得到：Boc-Pglu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-樹脂。

2.3 Boc-pGlu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OH(化合物1)的制備

通過“2.2”項下制備出目標產物后，將“2.2”項下產物用DMF洗滌4次，異丙醇洗滌2次，抽極干。接著向反應體系里加入1%TFA/DCM溶液150 mL，搖擺反應10 min，收集反應液，重復6次，濃縮反應液，加10%檸檬酸溶液，析出白色固體，過濾，水洗至中性，真空干燥。得到化合物129.8 g，純度為91.9%，收率為91%。RP-HPLC圖見圖2；其裂解的無保護樣品ESI-MS圖見圖3。

圖2 化合物1的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of compound 1

圖3 化合物1 ESI-MS分析圖譜Fig.3 ESI-MS analysis spectrum of compound 1

2.4 合成H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)

2.4.1 H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl的合成

稱Fmoc-Arg(Pbf)-OH，100 mmol，65 g，BOP 110 mmol，49 g溶于500 mL DMF中，冷浴10 min，加入TEA 110 mmol，12 g。然后稱取H-Pro-NHEt.HCl，110 mmol，20 g，用100 mL DMF+12 g TEA溶解，倒入上述反應液，反應2 h，HPLC顯示反應完全，加入0.5 M鹽酸析出，過濾，得白色固體產物，真空干燥，得產物87.4 g，其收率為108%，純度為96.8%。RP-HPLC圖見圖4。

圖4 化合物H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of compound H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl

2.4.2 合成H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)

將“2.3.1”項產物用二乙胺500 mL溶解，攪拌30 min，HPLC顯示反應完全。濃縮除去二乙胺，加石油醚析出，得到白色固體H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt，真空干燥，得產物51 g，其收率為92.6%，純度為97.5%。RP-HPLC圖見圖5,ESI-MS圖見圖5。

圖5 化合物2的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of compound 2

2.4.3 H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)的的ESI-MS分析

對化合物2進行ESI-MS分析，可知化合物2[M+1]+峰為M/Z為552.1，與理論值550.9一致。見圖6。

圖6 化合物2 ESI-MS分析圖譜Fig.6 ESI-MS analysis spectrum of compound 2

2.5 丙氨瑞林粗品的合成

2.5.1 丙氨瑞林前體的合成(化合物3)

取第一中間體(化合物1)10 mmol，13 g和BOP 11 mmol，4.9 g溶于20 mL DMF，-5 ℃冷浴10 min，另取第二中間體(化合物2)12 mmol，6.6 g，溶于20 mL THF中，反應2 h，HPLC檢測反應完全。過濾除去白色固體，濃縮，加入0.5 M鹽酸溶液，析出類白色固體，過濾，水洗至中性。真空干燥，得產物丙氨瑞林前體(化合物3)15.8 g，其產率為86.3%，純度為91%。RP-HPLC圖見圖7。

圖7 化合物3的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of compound 3

2.5.2 丙氨瑞林粗品的合成

取100 mL圓底燒瓶，稱丙氨瑞林前體(化合物3)5 mmol(9.2 g)投入，加入切肽試劑(TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5)切割，得到含有丙氨瑞林粗品的TFA溶液。濃縮TFA溶液至少量，加入乙醚。離心，真空干燥得丙氨瑞林粗品5.3 g，其純度為91%，收率為83%。RP-HPLC圖見圖8，MS圖見附圖9。

圖8 丙氨瑞林粗品的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of crude alarelin

圖9 丙氨瑞林粗品ESI-MS分析圖譜Fig.9 ESI-MS analysis spectrum of crude alarelin

2.6 樹脂回收

將樹脂用DMF洗滌三次，甲醇洗滌三次，抽去濾液，真空干燥。另配置二氯亞砜的DCM溶液，加入裝有樹脂的固相合成反應器中，反應2 h后，抽去反應液，DCM洗滌。

3 結 論

丙氨瑞林作為臨床使用藥物，現階段對其藥理活性研究較多，其合成研究相對較少。目前，在現有技術中，申請號為CN201710851059.5提供一種丙氨瑞林的固相制備方法[5]，該制備方法采用全固相合成的方式，反應簡單可控，但因肽鏈較長，固相合成后期可能副產物較多，此外，現有技術多采用哌啶作為脫帽試劑，該試劑為易制毒管制試劑，采購及運輸較為困難。本研究采用固液組合合成方式，前七個氨基酸(Boc-pGlu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OH)采用固相合成方式，反應簡單，純度為91.9%，收率為91%，最后兩個氨基酸(H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt)及丙氨瑞林粗品均采用液相合成的方式，降低了生產成本，減少了副產物的生產。

本研究利用多肽固相及液相合成結合法成功合成了丙氨瑞林，該方法操作簡單，CTC樹脂合成片段可以方便自動化生產且成本較低，純度高，反應條件溫和，適合大規模工業化生產。