蕓豆酵素復合發酵工藝優化及功能性分析

王 迪 王 穎,2,3 張艷莉 佐兆杭劉淑婷 張 裕 李志芳

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319)(國家雜糧工程技術研究中心；黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室2,大慶 163319)(糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319)

食用酵素是以一種或多種新鮮果蔬、藥食同源食材等為原料，經多種益生菌發酵制得的富含酶、益生菌、礦物質和次生代謝產物等營養物質的功能性微生物發酵產品[1,2]。食用酵素既可最大程度保留植物原料的營養成分，又可通過有益微生物的代謝產生功能性小分子活性物質。食用酵素具有減肥降血脂[3,4]、解酒護肝[5]、美白抗氧化[6-8]、防治心血管疾病[9]等功效。以谷物作為益生菌載體的食用酵素可以解決傳統發酵乳制品高脂高膽固醇等問題，同時為乳糖不耐癥人群攝入益生菌提供新思路。目前研究多集中在工藝優化及功能性分析方面。洪厚勝等[10]利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌多菌種共同發酵葡萄果渣并優化工藝參數，經測定葡萄果渣酵素SOD活力可達988 U/mL，相較于發酵前提高了1.19倍。王輝等[11]探究青梅酵素生物活性及抑菌性，結果表明其抗氧化性及酶活性較強，對致病菌有明顯抑制作用。

蕓豆(Phaseolus vulgaris Linn)學名菜豆，又名四季豆，廣泛種植于內蒙古、云南、黑龍江、遼寧等11個省、自治區，已成為栽培面積僅次于黃豆的食用豆類農作物[12]。蕓豆富含蛋白質、B族維生素、礦物質等營養成分，同時含有多種人體必需氨基酸，其中賴氨酸和色氨酸含量相對較高[13,14]。蕓豆中α-淀粉酶抑制劑可有效改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠高脂血癥、胰島素抵抗并提高其機體免疫力，降低機體氧化應激及高血糖靈敏度，并以低毒性有效防止血管組織的病變[15-17]；蕓豆多肽，如凝集素、蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑、抗真菌蛋白等，可用于抵御如真菌和細菌等病原微生物及食肉昆蟲對植物的侵害[18]；蕓豆抗性淀粉具有防預治療胃損傷、糖尿病、腸癌等功效[19,20]。蕓豆富含的多種生物活性物質在疾病防治方面具有巨大潛力，還可被作為天然的抗氧化劑、色素、甜味劑應用于食品、化妝品、藥品等相關行業，以安全性高、來源廣泛、見效迅速的優點，在人類生活中扮演重要角色[21,22]。

蕓豆主要以鮮食為主，存在綜合利用程度低及高值轉化差等問題，目前鮮見復合益生菌發酵蕓豆酵素的研究，其工藝優化及功能性也鮮有報道。因此，本研究以黑龍江省地區主產紫花蕓豆為研究對象，采用響應面法優化蕓豆酵素發酵工藝參數，探究其抗氧化活性及體外抑菌性，以期提高蕓豆附加值，同時為蕓豆酵素系列產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆；白砂糖；活性干酵母；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；志賀氏菌(Shigella)；大腸桿菌(Escherichiacoli)；沙門氏菌(Salmonella)；耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)；糖化酶(10 000 U/mL)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒；羥自由基試劑盒；福林酚(10%)。

1.2 儀器與設備

JYL-Y912料理機，S220 pH計，H1850R冷凍離心機，BCV-6S1超凈工作臺，DRP-9082電熱恒溫培養箱，V-5100B可見分光光度計，YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

蕓豆去皮清洗→打漿均質→液化→糖化→離心→滅菌→接種→發酵→后發酵

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酵母菌、乳酸菌

1.3.2 操作要點

菌種的活化與培養:取甘油保存的菌液100 μL于MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，無菌操作臺中劃線接入MRS固體培養基中培養(37 ℃，24 h)，連續接種3代，使其充分活化。挑取斜面培養基生長較好菌落接種至液體培養基中培養(37 ℃，24 h)，搖勻后移取1%菌液至液體培養基(37 ℃，24 h)，得到擴大培養的乳酸菌菌懸液，待用。活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，菌液待用。

蕓豆清汁的發酵：紫花蕓豆清洗后去皮，按1∶3(g/mL)料水比打漿。雙酶法進行水解，液化條件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH 6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化條件：加酶量200μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時間30 min。酶解液于高速離心機中以1.0×104r/min離心15 min，得到蕓豆清汁。調清汁pH 5.0、裝瓶量30 mL、糖添加量8%后滅菌。冷卻后接種0.2%酵母菌，32 ℃恒溫振蕩24 h進行預發酵，按1∶1(共同發酵)比例接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌恒溫發酵24 h。-4 ℃后發酵并保藏備用。

1.3.3 單因素實驗設計

蕓豆清汁初始pH 5.0，添加8%白砂糖后滅菌，接種3%復配乳酸菌，32 ℃發酵24 h，測定蕓豆酵素SOD活力。固定其他條件，分別考察糖添加量、初始pH、接種量、發酵溫度對發酵液SOD活力的影響。

1.3.4 響應面實驗設計

利用Design-Expert 8.06軟件中Box-Behnken模型，以糖添加量、初始pH、接種量、發酵溫度4個單因素為自變量，發酵液SOD活力為響應值，優化發酵工藝參數。實驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

1.3.5 SOD酶活力測定

使用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒測定。

1.3.6 抗氧化實驗1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL樣品溶液與2 mL 0.02 mg/mL DPPH-乙醇溶液混勻，室溫下暗反應30 min，空白組以無水乙醇代替試樣，517 nm處測定樣品吸光度值[23]。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用無水乙醇代替DPPH時測得對應濃度的本底吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力測定

使用羥自由基測試試劑盒測定。

1.3.7 蕓豆酵素體外抑菌活性測定1.3.7.1 菌懸液的制備

無菌條件下，將金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌接種于LB固體培養基，37 ℃培養24 h，活化兩次。取1環活化后菌種接種于LB液體培養基，37 ℃培養至對數生長期，菌懸液重懸稀釋后進行平板計數，使菌懸液中菌數保持在1×107～2×107CFU/mL，備用。

1.3.7.2 蕓豆酵素抑菌活性的測定

吸取100 μL菌懸液于LB固體培養基上，涂布器涂開。打孔器在固體培養基上打孔，分別吸取20、40、80、160、320 mg/mL的蕓豆酵素0.2 mL于孔中，無菌水為空白對照。培養基37 ℃恒溫培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

由圖1可知，SOD活力隨糖添加量增加而升高，超過一定范圍后下降，推測發酵液滲透壓增高，造成細胞壁特性發生改變，同時抑制細胞膜上氨基酸轉運蛋白等物質活性，影響細胞膜流動性[24]。此外，菌種細胞收縮及胞內水流出，造成生長周期停滯和凋亡等多種生物過程的破壞[25]，致使發酵無法正常進行。

圖1 單因素實驗結果

SOD活力隨著初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢，推測SOD化學本質為蛋白質，其分子內部規律性結構易受pH、溫度等物理或化學因素影響，導致氫鍵斷裂進而空間結構被破壞，酶活性降低。

增大接種量，SOD活力未增加卻大幅度降低，推測接種量過低，易污染雜菌形成不利于菌種增殖生長的環境[26]；接種量過高，菌體發酵速度過快，易造成微生物細胞衰老而自溶，影響風味。

隨著發酵溫度的升高，SOD活力逐漸增大，而溫度過高時SOD活力呈降低趨勢，分析原因溫度升高加快微生物繁殖代謝。但過高縮短發酵周期，同時改變氣體傳遞速率及溶解度，降低發酵液溶氧量，影響微生物正常生長代謝。

2.2 響應面實驗結果分析

2.1.1 響應面結果及分析

響應面設計各因素水平的蕓豆酵素SOD活力見表2。對表2實驗結果進行回歸擬合，所得回歸方程為：Y=215.63+1.58A-2.18B+5.24C+2.97D-1.94AB-1.80AC-4.28AD+6.16BC-5.05BD-1.92CD-23.79A2-18.30B2-19.65C2-11.23D2。

表2 響應面實驗設計與結果

表3 回歸方程方差分析及結果

方程一次項中C項對蕓豆酵素SOD酶活力的影響達到極度顯著水平(P<0.000 1)，B項和D項達到高度顯著水平(P<0.01)，A項達到顯著水平(P<0.05)，即各因素對蕓豆酵素SOD活力影響順序依次為初始pH>接種量>糖添加量>發酵溫度。

2.1.2 交互作用分析

各因素交互作用等高線圖呈橢圓形，說明交互作用顯著。響應面對比可知，初始pH、糖添加量和接種量曲面彎曲程度較大，表明對發酵液SOD活力影響顯著，與回歸方程的方差分析結果一致。經Design Expert 8.06優化蕓豆酵素發酵工藝參數：糖添加量6.08%，初始pH 3.94，接種量3.23%，發酵溫度為32.53 ℃，此條件下發酵液SOD活力預測值可達216.213 U/mL。為驗證實驗結果真實性，考慮到實踐操作可行性，優化工藝參數為發酵溫度32 ℃、糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量3%，重復3次實驗進行驗證，得到蕓豆酵素SOD活力為215.12U/mL(誤差0.51%)，證明優化的工藝參數具有準確性。

2.2 不同發酵階段蕓豆酵素抗氧化活性分析

2.2.1 不同發酵階段蕓豆酵素DPPH自由基清除率變化

蕓豆酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化如圖2所示。整個發酵過程中蕓豆酵素均對DPPH自由基具有一定的清除能力，呈現先迅速上升后趨于平緩的趨勢。與發酵0 h相比，發酵8 h的蕓豆酵素DPPH自由基清除率迅速增長2倍，隨后以小幅度趨勢增長，說明適當延長發酵時間可明顯提高蕓豆酵素DPPH自由基清除能力。發酵過程中DPPH自由基清除率顯著上升，至發酵結束達90.57%，分析原因可能與酚類物質有關，其較容易給出一個氫離子并通過共振雜化而穩定[27]，同時發酵過程中產生如超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶，兩者共同作用是高DPPH自由基清除率的原因。

圖2 蕓豆酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化

2.2.2 不同發酵階段蕓豆酵素羥基自由基清除率變化

蕓豆酵素發酵過程中羥基自由基清除率的變化情況如圖3所示。羥基自由基的清除能力隨發酵時間的延長呈現持續增長的趨勢，最終增長至88.06%。羥基自由基清除能力的提高可能是由于有機酸、維生素具有自由羥基的酚類物質，A環或B環上有自由的3-羥基取代或有多羥基取代的黃酮化合物，多酚類物質分子內含大量的酚羥基，提供活潑的氫，可終止自由基連鎖反應[28]。多種因素共同作用提高發酵液自由基清除能力。

圖3 蕓豆酵素發酵過程中羥基自由基清除率的變化

2.3 蕓豆酵素抑菌活性分析

由圖4和表4可知，蕓豆酵素對4種致病菌均有抑制作用，隨著濃度升高抑菌圈直徑顯著增大(P<0.05)。當蕓豆酵素濃度為320 mg/mL時，均處于15～20 mm的高敏范圍。其中，相較于革蘭氏陰性菌(沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌)，蕓豆酵素對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抑制效果更強，與相關文獻報道的研究結果相一致[29]。原因在于供試菌種細胞壁組成不同，革蘭氏陽性菌細胞壁大部分由位于表面的肽聚糖構成，溶菌酶等抑菌成分可直接作用其表面進而抑制肽聚糖的合成并溶解細菌。而陰性菌細胞壁主要成分為脂多糖和脂蛋白，可一定程度防止其細胞結構被外界破壞[29]。

圖4 蕓豆酵素產生的抑菌圈效果圖

表4 不同濃度蕓豆酵素的抑菌活性

3 結論

蕓豆酵素發酵最優工藝條件為發酵溫度32 ℃、糖添加量6%、初始pH4.0、接種量3%，此條件下發酵液SOD活力為215.12 U/mL。發酵使蕓豆酵素DPPH自由基清除率及羥自由基清除率顯著增長，至發酵結束其清除率分別為90.57%和88.06%，證明經工藝優化后的蕓豆酵素具有良好的抗氧化活性。采用擴散法考察不同濃度蕓豆酵素對致病菌抑菌效果，結果表明蕓豆酵素抑菌活性隨濃度升高而增強，且對革蘭氏陽性菌抑制效果更強。經此工藝優化后的蕓豆酵素色澤通透，氣味綿柔，具有良好的功能活性。