銹赤扁谷盜侵染后小麥自身揮發性化合物動態變化研究

郝佳容 黎天天 陳 鑫 姜 彬 劉興泉 張 濤

(浙江農林大學農業與食品科學學院1，杭州 311300)(國家糧食和物資儲備局科學研究院2，北京 100037)(國家留學基金管理委員會信息資源部3，北京 100044)

銹赤扁谷盜Cryptolestesferrugineus(Stephens)屬鞘翅目(Coleoptera)扁谷盜科(Laemophloeidae)，是一種常見的儲糧害蟲，廣泛分布于世界各地的溫帶和熱帶地區[1]。它是一種菌食性害蟲，常出現于有霉菌或腐敗的糧食上，相對于質量完好的糧食而言，有霉變的糧食更為其所喜食[2]。近年來，銹赤扁谷盜危害嚴重、防治困難，給儲糧安全帶來嚴重影響[3-5]。

小麥是全世界三大谷物之一，總產量位居第二的糧食作物。中國是世界最早種植小麥的國家之一。小麥揮發性化合物在儲藏過程的變化規律與品質有很好的相關性，可作為品質劣變的早期指標[6]。小麥儲藏過程中，除了其本身氣味以外，還包括儲藏周期內小麥自身的各種代謝作用以及害蟲侵染產生的揮發性化合物[7]。目前，已有研究報道，小麥在儲藏過程中產生的揮發性化合物主要為一些羥基化合物，如醛、酮，還有少量醇類等[8]。張玉榮等[9]利用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜(HS-SPME-GC-MS)對蛀蝕性害蟲侵染后小麥的揮發性成分進行研究，發現隨著侵害時間的延長，侵染后小麥的多類化合物出現下降或上升的趨勢。張藍月[10]、袁建等[11]利用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜(HS-SPME-GC-MS)對不同儲藏條件下的小麥粉揮發性成分進行研究，發現小麥粉中揮發性成分含量最高的是烴類，其次為醛類、醇類、酮類。

固相微萃取(Solid-Phase Micro-extraction，SPME)技術是近年來快速發展起來的一種主流技術，具有高效、自動、靈敏、無溶劑萃取等優點[12]。目前固相微萃取的方式主要分為2種[13]，一是浸入固相微萃取(DI-SPME)，纖維膜直接浸入液體樣品中對中低揮發性化合物進行富集；二是頂空固相微萃取(HS-SPME)，纖維膜暴露于樣品中，對液態-氣態基質進行吸附[14]。固相微萃取技術常與氣相色譜質譜聯用技術(GC-MS)相結合，對樣品中揮發性化合物進行定性、定量分析，廣泛應用于環境、食品和生物中[15-19]。

本實驗利用SPME-GC-MS技術，研究不同蟲口密度銹赤扁谷盜侵染后以及不同儲藏周期內小麥揮發性化合物的動態變化，探究在2個因素的影響下，小麥揮發性化合物的種類及其含量變化，建立小麥揮發性化合物與儲藏品質的聯系，為小麥儲藏過程中的快速檢測技術、風險評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥(魯源502)：河北省衡水市2018年冬小麥，含水量12.7%。將小麥樣品裝入自封袋中，于-4 ℃條件下儲存1周，以除去小麥中的有害生物[20]，后置于4 ℃冰箱中儲存備用。小麥粉：采用小型實驗磨粉機將部分低溫冷凍處理后的小麥進行磨粉備用。

試蟲：銹赤扁谷盜，鄭州品系，由國家糧食和物資儲備局科學研究院害蟲飼養室飼養。飼料：全麥粉、燕麥片和酵母粉按質量比5∶4∶1混合飼料。培養條件：(25±0.5) ℃、(65±5)% RH，實驗采用羽化后1～2周的成蟲。

試劑：乙腈(HPLC級)。

1.2 儀器與設備

HWS恒溫恒濕培養箱，FW-400小型磨粉機，7890A/5975C氣相色譜質譜聯用儀，(5%)-二苯基(95%)-二甲基亞芳基硅氧烷共聚物HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，2 cm聚二甲基硅氧烷/碳分子篩/二乙烯苯(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm萃取進樣頭，20 mL頂空萃取瓶，HH-4數顯恒溫水浴鍋，5427R離心機，KQ-250DE超聲清洗器。

1.3 方法

1.3.1 銹赤扁谷盜侵染實驗

培養瓶瓶口涂抹一層聚四氟乙烯，晾干后在電熱鼓風干燥箱中80 ℃烘1 h，冷卻后用于侵染實驗，可防止銹赤扁谷盜逃逸。往培養瓶中加入76 g小麥和4 g小麥粉，混勻；按照3組蟲口密度接種，1組為空白對照組(WCF-CK)，接種0頭銹赤扁谷盜成蟲，另外2組分別接種10頭銹赤扁谷盜成蟲(WCF-10)和100頭銹赤扁谷盜成蟲(WCF-100)。采用濾紙封口后，放入(25±0.5) ℃、(65±5)% RH培養箱中培養4周，每周取樣進行測定。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS檢測條件

萃取條件：參照牛永浩[20]、Laopongsit等[21]方法的基礎上，對萃取條件進行優化。優化后，稱取8 g樣品于20 mL頂空瓶中密封，萃取溫度70 ℃，水浴平衡30 min，萃取時間70 min，250 ℃解析3 min。

色譜條件：采用(5%)-二苯基(95%)-二甲基亞芳基硅氧烷共聚物HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣，流速為1.0mL/min，保持恒定流速；色譜柱升溫程序：柱初溫為45 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃，在250 ℃保持5 min，整個升溫程序共運行51 min，選擇不分流進樣模式。

質譜條件：進樣口溫度250 ℃，接口溫度280 ℃，離子源為EI源，四極桿質譜，四極桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV，采用質譜全掃描方式進行信息采集，質譜質量掃描范圍為50～550 amu，溶劑延遲時間為2 min。

1.3.3 DI-SPME-GC-MS檢測條件

萃取條件：稱取8 g樣品于20 mL頂空瓶中，加入10 mL乙腈，振蕩30 s，6 000 r/min離心3 min，取上清液1 mL于2 mL進樣瓶中，將SPME手動進樣器針頭插入待測液底部萃取50 min，270 ℃解析15 min。

氣相色譜條件：采用(5%)-二苯基(95%)-二甲基亞芳基硅氧烷共聚物HP-5MS毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min，保持恒定流速；色譜柱升溫程序：柱初溫為60 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升溫至200 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫至300 ℃，保持4 min，整個升溫程序共運行57 min。

質譜條件：接口溫度280 ℃，離子源為EI源，四極桿質譜，四極桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV，采用質譜全掃描方式進行信息采集，質譜質量掃描范圍為50～550 amu，溶劑延遲時間為3 min。

1.3.4 定性定量分析

將GC-MS檢測出的各化合物質譜圖與NIST08標準質譜庫和Wiley8標準質譜庫中的質譜圖比對，結合保留指數來對化合物進行定性分析。統計匹配度大于80的有機化合物，采用峰面積歸一化法對揮發性成分進行定量分析。

1.4 數據處理

采用 Microsoft Excel 進行數據預處理；應用SIMCA-P(Version 14.1)程序對不同處理組數據進行PLS-DA判別分析，通過置換檢驗(Permutation Test)的顯著性對模型進行穩定性檢驗，再根據變量投影重要性(VIP)值的顯著性對差異化合物進行篩選；采用TBtools分析軟件對差異化合物進行熱圖繪制及層次聚類分析(HCA)。

2 結果與分析

2.1 不同儲藏周期小麥揮發性化合物的質譜分析

采用DI-SPME-GC-MS技術，對不同儲藏周期小麥樣品的揮發性化合物提取分析，小麥樣品揮發性物質的總離子流圖(圖1)。結合化合物匹配度、保留時間、保留指數等信息對數據進行鑒定，共定性出18種揮發性化合物成分，詳見表1。大部分化合物隨儲藏周期的延長呈波動變化，沒有明顯趨勢。其中棕櫚酸、二十三烷、二十五烷、二十七烷、二十九烷、9-辛基-二十烷、三十一烷、11-癸基二十一烷含量相對較高。

表1 DI-SPME方式萃取不同儲藏周期小麥揮發性化合物定性結果

圖1 DI-SPME萃取小麥揮發性物質的色譜圖

采用HS-SPME-GC-MS技術，對不同儲藏周期小麥樣品的揮發性化合物提取分析，小麥樣品揮發性物質的總離子流圖(圖2)。結合化合物匹配度、保留時間、保留指數等信息對數據進行鑒定，共定性出39種揮發性化合物成分，詳見表2。主要揮發性成分為正己醛、庚醛、2-正戊基呋喃、2-乙基己醇、苯乙醛、壬醛、正壬醇、萘、正十二烷、正癸醛、十三烷、γ-壬內酯、十七(碳)烷、十七烷酮，其中正己醛相對含量隨儲藏周期的延長呈上升趨勢，苯乙醛隨儲藏周期的延長呈下降趨勢，其他部分主要揮發性成分隨儲藏周期的延長呈波動上升或下降趨勢。

圖2 HS-SPME萃取小麥揮發性物質的色譜圖

表2 HS-SPME方式萃取不同儲藏周期小麥揮發性化合物的定性結果

續表2

通過比對鑒定結果和色譜圖，發現HS-SPME出峰時間集中在前期和中期，大部分以C10～C20化合物為主，屬于中高揮發性化合物；DI-SPME出峰時間多在中期和后期，化合物碳數多集中在C20～C30范圍內，屬于中低揮發性化合物。2種萃取模式下共檢測到酸類5種、醛類12種、醇類3種、烴類22種、酯類7種、酮類9種和其他3種。

2.2 銹赤扁谷盜侵染不同儲藏周期小麥各類揮發性化合物的變化

銹赤扁谷盜侵染小麥樣品的定性、定量檢測結果顯示，檢測出的揮發性化合物類型主要為醛類、烴類、醇類、酯類、酸類和其他物質，詳見表3。

表3 4周內銹赤扁谷盜侵染后小麥中各類揮發性化合物質量分數變化/%

儲藏4周后，各類揮發性化合物相對含量的變化以及與空白對照組小麥相比變化幅度如圖3所示。隨儲藏時間的延長，銹赤扁谷盜侵染后小麥醇類化合物相對含量呈上升趨勢，主要由2-乙基己醇引起，呈柑橘香氣，醇類化合物是小麥香氣重要的化合物，通常具有花香、植物香；酮類、酯類化合物相對含量先上升后下降；烴類、醛類是6大類化合物中相對含量較高的化合物，呈現波動變化，變化不明顯。酸類化合物隨著蟲口密度及儲藏時間的增加，相對含量呈急劇上升的趨勢，在銹赤扁谷盜侵染第3周達到最大值27.55%，約為空白對照小麥樣品的9倍，其中γ-亞麻酸是銹赤扁谷盜侵染后才被檢出，這說明侵染對小麥的脂類物質影響較大，可以初步作為判別小麥受銹赤扁谷盜侵染程度的標志物之一，仍需進一步研究驗證。

圖3 不同儲藏期內被銹赤扁谷盜侵染后小麥各類揮發性化合物相對含量變化及變化倍數

2.3 不同蟲口密度侵染后小麥樣品揮發性化合物差異分析

2.3.1 主成分分析(PCA)

主成分分析(PCA)是一種無監督的分析模式，客觀地根據變量信息，降維后對樣品進行分類[22]。運用主成分分析并不能很好地區分不同處理組的小麥樣品，樣品間存在離散與重合現象，如圖4所示，說明樣品間揮發性化合物的組成及含量存在相似的可能，但不同儲藏周期也造成了樣品的組內差異。因此，PCA模型無法消除組內與研究目的無關的變量，不能很好地發現組間差異。

圖4 不同蟲口密度銹赤扁谷盜侵染小麥揮發性化合物PCA得分圖

2.3.2 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)

PLS-DA是一種有監督的分析模式，即在預知分類的條件下根據樣品信息對訓練樣品集建立判別模型[23]。根據揮發性化合物組成和相對含量，對3個蟲口密度的揮發性化合物進行PLS-DA分析，建立不同蟲口密度判別分析模型，圖5為PLS-DA得分圖，即為各樣品點在主成分1和主成分2構成的平面上的垂直投影得分值，圖6為Hotelling T2分布圖。

圖5 不同蟲口密度銹赤扁谷盜侵染小麥揮發性化合物PLS-DA得分圖

注：a1～a4分別表示銹赤扁擬谷盜侵染，蟲口密度為0的條件下儲藏第1周、第2周、第3周、第4周；b1～b4分別表示銹赤扁擬谷盜侵染，蟲口密度為10的條件下儲藏第1周、第2周、第3周、第4周；c1～c4分別表示銹赤扁擬谷盜侵染，蟲口密度為100的條件下儲藏第1周、第2周、第3周、第4周。圖8亦同。圖6 Hotelling T2分布圖

圖7PLS-DA模型置換驗證圖

由圖5和圖6可知，36個樣品的相似度均在95%的置信區間內，不同蟲口密度侵染后小麥樣品存在聚類趨勢，未發現離群樣品點，說明建立的PLS-DA模型可以對36個樣品進行判別分析。運用PLS-DA模型分析過程中共得到7個主成分，建立的模型可以將3個蟲口密度明顯區分(圖5所示)。結果表明，本研究建立的PLS-DA模型有良好的擬合參數；R2(X)=0.89，R2(X)越接近1，模型越穩定；R2(Y)=0.982，R2(Y)越大，模型的解釋能力越強，說明該模型可以解釋98.2%的原始數據；Q2=0.922大于0.5，說明模型的預測性好[24]。

2.3.3 PLS-DA模型的可靠性驗證

分別對3個蟲口密度的判別模型進行20次置換后驗證，結果如圖7所示。3個模型Q2的一元線性回歸曲線在縱軸上的截距均小于0，說明3個模型均不存在過擬合現象，模型可靠，可用于不同蟲口密度侵染后小麥樣品的判別分析。

2.3.4 不同蟲口密度侵染后小麥樣品差異揮發性化合物判別分析

以揮發性化合物的變量投影重要性(VIP)值為指標，考慮不同蟲口密度侵染后小麥樣品的數據特征，量化PLS-DA模型的每個變量對判別的貢獻。VIP值越大，該揮發性化合物在不同蟲口密度侵染后小麥樣品之間的差異越大，越對分類起著關鍵的作用。通常認為VIP值大于1的變量在不同類別之間差異顯著，本實驗篩選到17種差異揮發性化合物。

使用SPSS 22.0對17種差異揮發性化合物數據進行Kruskal Wallis檢驗。基于VIP值(VIP>1)、P值(P<0.05)，進一步篩選出9種關鍵差異揮發性化合物，詳見表4。

表4 PLS-DA模型中VIP值大于1的化合物P值及其萃取方式

2.4 不同蟲口密度侵染后小麥差異揮發性化合物層次聚類

對篩選出的9種差異揮發性化合物進行層次聚類分析，蟲口密度為 0、10和 100的銹赤扁谷盜侵染的小麥揮發性化合物的變化以熱力圖形式呈現(圖8)，其中橫軸為不同蟲口密度處理的實驗分組，縱軸代表各處理組篩選后的差異揮發性化合物，區塊顏色的深淺表示揮發性化合物含量的高低(紅色表示含量高，藍色表示含量低)。

圖8分為三部分，第一部分是左側12列，表示未被銹赤扁谷盜侵染的小麥樣品即侵染蟲口密度為0 時的小麥樣品(WCF-CK)；第二部分是中部12列，表示被 10頭銹赤扁谷盜侵染后的小麥樣品(WCF-10)；第三部分為右側12列，表示被 100頭銹赤扁谷盜侵染的小麥樣品(WCF-100)。通過顏色分布可知，最右側區域即被100頭銹赤扁谷盜侵染后的小麥差異揮發性化合物樣品中紅色或橘紅色區域較多，這與差異揮發性化合物含量增加的鑒定結果相符合；中間區域較右側區域顏色略淺，紅色或橘紅色區域在底部有明顯聚集，對應的揮發性化合物為2-十九烷酮、二十九烷；其他區域中，左側部分顏色整體最淺，但其中也夾雜有橘紅色的高含量化合物，比如最頂部紅色區域，對應的揮發性化合物為γ-己內酯，是空白對照組的標志化合物，與揮發性化合物鑒定結果相符合。這說明外界條件的改變會顯著影響到每個樣品差異揮發性化合物的表達量。圖8表明隨著銹赤扁谷盜侵染數量的上升，小麥特征揮發性化合物隨之發生變化，在侵染小麥一周后，銹赤扁谷盜侵染后不同小麥樣品間的差異便體現出來，印證了所篩選出的小麥差異揮發性化合物可以作為標志化合物，以體現出各樣品間的差異性。

圖8 9種差異揮發性化合物層次聚類熱力圖

3 結論

通過SPME-GC-MS對不同蟲口密度銹赤扁谷盜侵染及不同儲藏周期的小麥自身揮發性化合物動態變化進行分析，探究了在小麥儲藏期間內不同蟲口密度銹赤扁谷盜侵染對小麥揮發性化合物的影響，通過監測關鍵差異揮發性化合物含量來判別小麥受銹赤扁谷盜侵染程度。結果表明，WCF-CK、WCF-10、WCF-100 3組樣品在兩種固相萃取模式下共定性、定量檢測出61種揮發性化合物，其中HS-SPME共富集到40種揮發性化合物，DI-SPME富集到21種揮發性化合物。基于揮發性化合物，運用PLS-DA可以實現良好分離，其中R2(Y)=0.982,Q2=0.922說明該模型具有良好的穩定性和預測性。PLS-DA得到VIP值，篩選到9種差異揮發性化合物，為γ-亞麻酸、2-十九烷酮、γ-己內酯、十七烷酮、二十九烷、二十七烷、二十七烷醇、1-碘-2-甲基十一烷、壬醛，說明銹赤扁谷盜的侵染可能會干擾儲藏過程中小麥的代謝機制，影響其揮發性化合物的形成；層次聚類分析表明差異性揮發性化合物作為標志化合物可以體現出各樣品間的差異性，因此，儲藏周期及蟲口密度對小麥揮發性化合物的表達量會產生顯著影響。