檢測角度對激光誘導熒光光譜技術檢測花生油AFB1污染的影響研究

陳 敏 龐妍妍 何學明 沈 飛

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇高?，F代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

花生油顏色淡黃透明、滋味可口，具有適宜的油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸比例，易于身體消化吸收，且含有磷脂、維生素E、膽堿等對人體有益的物質，深受消費者喜愛[1]。花生作為花生油的原料，在生長、收獲和貯藏過程中極易受到真菌的侵染，而霉菌代謝產生的AFB1在花生油生產過程中，會侵入油相，從而導致花生油中毒素超標，對人類健康造成嚴重的威脅[2]。

目前，檢測AFB1的方法主要是薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法 (HPLC)[3]、酶聯免疫吸附法 (ELISA)等[4]。 然而，這些方法通常成本高、耗時長，難以實現現場實時快速檢測。近年來，光譜技術因樣品預處理簡單、快速無損等特點成為最具有檢測潛力的一類方法[5]。其中，熒光技術因高靈敏度、特異性強、操作簡單等優點，在農產品檢測方面得到了廣泛的應用[6，7]。具有熒光特性的物質受到紫外波段輻射激發后，會發射出比激發光波長更長的可見光，稱之為熒光。對于不同物質其分子構成不同，受輻射激發的波段、發出的熒光信號也不同。利用熒光技術檢測農產品中AFB1早有報道，1969年Marsh等[8]表明棉籽AFB1與藍綠色熒光 (blue green yellow fluorescence, BGYF)具有高相關性。近年來，基于熒光技術檢測葡萄酒[9]、玉米[10]、花生[11]、面粉[12]等農產品中存在的AFB1也有大量研究。與使用汞燈、發光二極管或氙燈等光源作為激發光的傳統熒光檢測方法相比，LIF檢測技術由于使用單一激發波長的高功率激光器，其靈敏度會更高[13]。Wu 等[14]利用研發的LIF系統對污染AFB1的開心果進行識別時，發現使用三個熒光探頭接收熒光時比只用一個熒光探頭的正確率高7%。這一結果說明當樣品受到激發光激發后，周圍均產生熒光。因此有相關學者研究了熒光檢測角度對實驗結果的影響。其中，有學者研究了不同角度的LIF技術檢測開心果中四種黃曲霉毒素[15]、牛奶的新鮮度[16]、橄欖油摻假[17]，結果表明當激光束與檢測光纖夾角為36°時，檢測開心果黃曲霉毒素的靈敏度和信噪比最高；樣品與光束之間的角度60°時，預測牛奶新鮮度效果最好；檢測角度為90°時，橄欖油摻假預測精度最高。由此可見自主研發的LIF系統對不同樣品光路是有區別的，其發射的熒光信號和散射光也是具有差異性的。因此，利用LIF技術精確檢測花生油中AFB1，選擇一個合適的檢測角度是至關重要的。

盡管有較多研究利用熒光技術檢測AFB1，而對于激光誘導熒光技術大多是鑒定食用油摻假問題，有少量報道該技術用于開心果、花生等堅果中AFB1的檢測，因花生油液體樣本復雜，受背景熒光干擾嚴重等問題，用LIF測定植物油中的AFB1尚未報道。因此，本研究擬研發一套LIF系統，比較不同熒光角度對檢測結果的影響，探索LIF技術在檢測花生油中AFB1的應用潛力。以花生油為研究對象，分析在不同角度下，花生油污染AFB1所產生的特征光譜，結合化學計量學方法，建立區分AFB1污染超標花生油的定性模型，并利用定量模型探討了樣品的熒光光譜與AFB1含量的相關性。以期為實現花生油中AFB1的快速識別和早期預警提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及樣品制備

一級花生油：市售，密度為 0.9 g/mL；黃曲霉毒素標品(純度≥98%)；乙腈(色譜純)；振蕩器；精密量角器。

為了驗證研發LIF系統檢測花生油中AFB1的可行性，優化系統的光路，用乙腈配制10 000 μg/L的AFB1標準溶液備用，每個樣品用50 mL的量筒準確量取40 mL花生油，根據國標對花生油中AFB1的限量標準，制備花生油污染AFB1水平為0、5、10、20、25、30、40、50 μg/kg，每個AFB1污染水平均配制15個樣品，另外準備15個純花生油作為對照組，總計135個樣品。每個樣品均是當天配制，配制好的樣品放置在振蕩器上振蕩5 min后，在黑暗中常溫靜置2 h后再采集光譜。LIF系統的3個檢測角度使用量角器精確測量后固定。樣品的詳細配制情況見表1。

表1 樣本制備的詳細情況

1.2 實驗方法

本研究自主研發的LIF光譜實驗裝置原理圖如圖1所示。實驗采用的是MW-GX-375的固體連續激光器作為激發光源(波長為375 nm，功率范圍0～137 mW可調)。激光束通過芯徑為1 000 μm的光纖經過準直鏡(COL-20K)垂直照射在樣品表面。置于比色皿中的20 mL樣品吸收激光能量后，釋放特征熒光經過長波通濾光片(LPF400)到準直鏡(74-uv-02)，從不同方向由芯徑為1 000 μm的光纖傳輸至光譜儀(QE pro)進行熒光光譜分析。光譜采集范圍為200～1 000 nm，積分時間設置為2 s，每個樣品采集兩次，光譜采集的整個過程均在避光的暗箱中進行，為避免環境變化對樣品采集的熒光產生不同影響，在實驗過程中必須保證實驗環境的一致性。

注：1 暗箱，2 光譜儀，3 電腦，4 接收準直鏡，5 濾光片，6 樣品臺，7 樣品，8 激發準直鏡，9 光纖，10 激光器，11 電源，12 可調整檢測熒光角度(30°、60°、90°)。圖1 LIF檢測系統示意圖

1.3 實驗數據處理

采用UnscrambleX 10.4和Matlab 2015b軟件對采集的熒光光譜進行分析處理。首先，建模之前先用ken-stone(KS)算法將數據集劃分為建模樣本集(總樣本數的2/3)和預測樣本集(總樣本數的1/3)。其次，運用主成分分析 (PCA) 分析污染不同水平 AFB1花生油的聚類趨勢，在通過線性判別分析 (LDA)、偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)、支持向量機 (SVM) 將樣品劃分成不超標 (AFB1污染水平<20 μg/kg) 和超標 (AFB1污染水平≥20 μg/kg)，建立偏最小二乘 (PLSR) 定量模型。評估定性模型的指標是判別正確率。評估PLSR模型性能的主要指標有：模型決定系數(R2)、建模均方根誤差(RMSEP)和預測均方根誤差(RMSEP)、相對分析誤差(residual predictive deviation, RPD)、最低檢出限(LOD)等，其中RPD為預測集標準偏差與預測均方根誤差的比值。

2 結果與分析

2.1 不同角度采集熒光信號的光譜分析

污染不同水平AFB1的花生油在3個檢測角度的平均熒光原始光譜如圖2所示。同一樣品在3個角度的熒光峰形狀相似，其中對照組的峰形與0 ppb組樣品峰形基本重疊，說明用乙腈配制的AFB1標準溶液對花生油熒光信號沒有影響。當研發的LIF檢測角度為60°時，樣品熒光強度最高，而研發的LIF檢測角度為30°時，樣品熒光強度最弱且熒光峰發生紅移。圖2顯示，不同污染水平樣品在400～600 nm、600～800 nm范圍的熒光峰存在明顯差異。植物油在350～420 nm激發下出現在610～800 nm的熒光峰與葉綠素有關[18]，而在400～600 nm的熒光峰應是由維生素B2、類胡蘿卜素以及脂肪酸的氧化產物等熒光團共同產生、疊合而成的熒光寬峰[19]。在紫外光的激發下，AFB1的熒光峰出現在428 nm左右[20]。從3個檢測角度采集熒光信號總體上都是隨著污染濃度的增加，熒光值也在增強，尤其是在400～600 nm，熒光強度增強幅度更大。這可能是低濃度的AFB1熒光信號會與花生油中的熒光物質發生交叉影響[21]。盡管熒光值隨著污染濃度的增加而增強，但在400～800 nm范圍內，沒有單個特征峰可以直接表示與AFB1相關，因此，為了提取與AFB1污染有關的關鍵光譜信息，需要借助化學計量學方法進一步分析400～800 nm的光譜。

2.2 主成分分析

利用所研發的LIF系統采集污染AFB1花生油的3個檢測角度的主成分分析結果如圖3所示?？傮w而言，超標花生油和不超標花生油在主成分得分圖上并不能完全區分開，尤其是當研發的LIF系統檢測角度為30°時，分離效果最差。這可能是由于熒光在30°檢測時受到散射效應的影響最大。也可能是微量的AFB1在花生油中熒光信號強度較低，而花生油本身的熒光容易掩蓋AFB1特性信號[22]。當研發的LIF系統檢測角度為60°和90°時，PC1和PC2 兩個主成分貢獻之和達到了84%。其中PC1占主要貢獻值?？赡芪镔|的大多數物理差異均是PC1導致的[23]，這為進一步的判別分析提供了基礎。

注：a 檢測角度為30°；b 檢測角度為60°；c 檢測角度為90°。

注：a為檢測角度為30°；b為檢測角度為60°；c為檢測角度為90°。

2.3 判別分析結果

花生油從不同檢測角度的3個判別模型結果如表2所示。當檢測角度為30°時，400～600 nm的預測集在判斷不超標樣本時正確率只達到81%，這可能是不超標樣本中AFB1含量太低，受花生油本身熒光影響大。另外，當研發的LIF檢測角度為60°時，在600～800 nm范圍建立模型的正確率整體要比其在400～600 nm建立模型的正確率高。盡管AFB1的熒光特征峰位于425～500 nm，但花生油在污染AFB1后光譜的差異性不僅是AFB1本身的差異性，還與樣品本身熒光物質有關[24]。然而，當研發的LIF檢測角度為90°，建模波段為400～600 nm時，SVM模型的各個指標正確率均達到100%。由此可見，當熒光檢測角度為90°時，可最大程度地減少透射光與散射光的影響[25]。因此，在研發LIF系統用于檢測判別花生油中AFB1是否超標時，檢測角度設置為90°，結合SVM在400～600 nm建立的判別模型可展現更高的精度優勢。

表2 污染AFB1是否超標的花生油樣品判別分析模型

2.4 花生油中AFB1含量的PLSR定量預測

表3 花生油中AFB1含量PLSR模型預測分析結果

3 結論