米糠蛋白糖基化與非酶褐變機理的研究

陶 醉 徐 麗 謝 嵐 全 珂 易翠平

(長沙理工大學化學與食品工程學院，長沙 410114)

米糠蛋白(Rice bran protein,RBP)作為一種優質植物蛋白，其開發利用對于我國農產品的增值與轉型具有重大價值[1-3]，但褐變一直是影響RBP大規模生產利用的技術瓶頸[4，5]。褐變產生的原因有酶促褐變和非酶促褐變，其中糖基化反應是一種氨基化合物與羰基化合物之間發生的非酶褐變反應[6]，也稱為美拉德反應[7]，可作為鑒定蛋白褐變的特征反應。王慧等[4]系統地研究了RBP的酶促褐變及非酶褐變現象，并篩選出還原糖引起非酶褐變的抑制劑，而關于還原糖導致RBP非酶促褐變原因尚不明確。王艷玲[8]對RBP 4種分級蛋白的物化和功能特性進行比較，發現分級蛋白之間的亞基分布情況存在差異，對4種分級蛋白的功能特性如溶解性等具有一定的影響，說明分級蛋白的結構與組成決定RBP的基本性質。近年來，關于分級蛋白的研究主要集中于提取與分析其組成上[8，9]以及功能特性和應用情況[10]，而對于分級蛋白的顏色變化、基本信息及糖類的結合情況鮮有報道。

本研究擬通過觀察RBP及其分級蛋白的顏色變化情況，深入研究其糖基化現象的存在及結構基礎，以明確其與RBP非酶褐變的關系以及非酶褐變的產生機理，對于將來抑制RBP褐變的產生、擴大其應用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

脫脂米糠：蛋白質14.68%、脂肪0.61%、灰分9.51%、水分13.57%，甘氨酸、N,N-亞甲基丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、丙三醇、2-巰基乙醇、考馬斯亮藍G250、甲基紅、碳酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

超聲波微波組合反應系統，DYCZ電泳儀，D25LT色彩色差儀，UV-2800分光光度計，5418R高速冷凍離心機，Savant DNA120離心濃縮儀，Triple TOF 5600 LC-MS質譜儀，FT-IR傅里葉紅外光譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 RBP及其分級蛋白的樣品制備

采用超聲輔助堿法[11-17]提取RBP。取脫脂米糠，加入蒸餾水使其分散均勻，調節固液比為1∶10。用少量NaOH調節pH并保持為9，超聲功率設置為120 W，料液比1∶9，超聲作用30 min，50 ℃水浴加熱2 h，4 000 r/min離心，收集上清液并調節pH至4，再次離心，沉淀經去離子水反復洗滌，干燥后得到RBP。將RBP分別在冷凍干燥機與鼓風干燥箱中干燥，選擇在50、60、70、80、90 ℃溫度梯度下烘干，粉碎后4 ℃冷藏備用。

根據Osborne連續提取法[18]提取RBP分級蛋白。取10 g脫脂米糠，加入100 mL水，常溫下攪拌提取后3 500 r/min離心收集上清液，重復以上步驟3次，匯集上清液置于去離子水中透析后冷凍干燥獲得水溶性蛋白；殘渣加入100 mL 5% NaCl溶液，攪拌后離心，重復處理3次后匯集上清液經透析后冷凍干燥得到鹽溶性蛋白組分；沉淀采用70%乙醇溶液溶解提取3次，匯集上清液置于去離子水中透析后冷凍干燥獲得醇溶蛋白組分；殘渣以0.1 mol/L NaOH溶解攪拌，依次經離心、透析、冷凍干燥處理即得堿溶性蛋白。提取后于4 ℃下冷凍干燥貯存待用。

1.3.2 RBP及其分級蛋白的色度測定

將RBP樣品放置于研缽中仔細研磨至均勻粉末。

為排除米糠本身所帶的色澤對分級蛋白色澤的影響，另取10 g脫脂米糠分級提取時經活性炭脫色，取濾液透析干燥處理后得到蛋白粉末。將分級提取中加入活性炭脫色后的蛋白與直接進行分級提取的蛋白對照。

色度均采用D25LT測色色差儀進行測定，待L*、a*、b*值穩定后，記錄數據，重復5次。

1.3.3 RBP分級蛋白的糖基化分析1.3.3.1 傅里葉紅外光譜分析

參考吳偉等[19]的方法，分別稱取2 mg RBP及分級蛋白樣品，與200 mg KBr混合，研磨均勻后制作透明薄片。在傅里葉紅外光譜儀上記錄樣品在400～4 000 cm-1范圍內的傅里葉光譜。室溫干燥環境下進行掃描，每個樣品掃描32次[19，20]。

1.3.3.2 分級蛋白糖基化電泳分析[21]

分級蛋白樣品經前處理后，參照Laemmli等[22，23]的方法，在不連續緩沖體系中，選擇12%的分離膠，4%的濃縮膠，膠版厚度為1 mm，進樣量為15 μL，過程中保持電流強度為20 mA，電泳至樣品條帶距膠版底部1 cm左右時停止，時間約2～4 h。G250染色約2 h后，反復脫色至條帶清晰，得到聚丙烯酰胺電泳后的膠條。而后參照Cerri等[24]的方法進行糖蛋白的染色。膠條的氧化在過碘酸溶液中進行，室溫浸泡過夜。移取10 mL冰醋酸溶液溶解稱取的1 g三氯醋酸，雙蒸水定容至100 mL，漂洗上述氧化的膠條。漂洗過后采用Shiff試劑置于暗處染色，定容至500 mL的棕色容量瓶中4 ℃儲存16 h，加入10 g活性炭后置于振蕩器上脫色、過濾至無色溶液。將溶液儲存于棕色試劑瓶中4 ℃保藏待用。染色后在5%醋酸溶液中脫色至無背景色僅殘余紅色區域時，掃描留存。

1.3.3.3 分級蛋白的LC-MS/MS鑒定

切下經聚丙烯酰胺電泳后得到的蛋白亞基條帶，蒸餾水多次沖洗除去膠上雜物。膠條加入150 μL脫色液脫色，水洗4次，依次采用300 μL 25 mmol/L碳酸、50%乙腈及100%乙腈2次洗滌，至膠塊變白。膠塊中加入10 μL DTT(10 mmol/L)后水浴還原，冷卻至室溫后等體積加入IAA(50 mmol/L)避光烷基化，按照上述洗滌過程洗至膠塊變白。然后采用15 μL蛋白質組學級胰蛋白酶(0.01 μg/μL)酶解處理，于冰上吸漲至透明，并覆蓋上30～40 μL溶液(溶液為含10% CAN的50 mmol/L NH4CO3)。處理后在37 ℃水浴條件下消化過夜。充分酶解后取上清液并對剩下的膠塊重新萃取(萃取液為含2%甲酸的67%乙腈溶液)，萃取后依次進行30 min 37 ℃保溫處理、15 min超聲處理后取其上清與酶解后的上清液合并。上清液濃縮干燥后待用[25]。

將上述處理后的樣品在Nano-LC流動相A(0.1%甲酸，2%乙腈/水)中溶解，以4 μL/min的流速上樣至ChromXP C18預柱上，并在此流速下沖洗脫鹽，在線LC-MS/MS分析。LC-MS/MS過程參數設置為：

液相：Ekspert nanoLC 415納升液相系統(SCIEX, Concord, ON)；樣品在預柱脫鹽保留后經分析柱分離，分析柱的選擇為C18反相色譜柱，實驗過程中的參數設定參考陳蘭煊等[23]的方法進行操作。

LC-MS/MS鑒定結果采用Maxquant軟件處理，數據庫為Uniprot下的oryza sativa japonica物種蛋白數據庫。

1.4 數據處理

采用Excel 2007分析并繪圖，運用SPSS進行數據差異顯著性分析。最終呈現的結果為其平均值±標準偏差。

2 結果分析

2.1 不同溫度處理對RBP及其分級蛋白顏色的影響

圖1是不同溫度下RBP的顏色變化。L*表示所測物體表面的明亮度，值大小與明亮度正相關；a*表示所測物體表面的紅綠值，+方向紅色增加，-方向表示綠色增加；b*表示所測物體表面的藍黃值，+方向黃色增加，-方向表示藍色增加。結果表明，相比冷凍干燥下得到的蛋白顏色，烘干條件下得到的蛋白顏色更深：隨著溫度的上升，蛋白的明亮度下降，紅褐度和黃褐度上升，褐變程度加深。

圖1 不同干燥溫度下的蛋白色度分析圖

RBP分級蛋白的色度測定結果見圖2。清蛋白與谷蛋白明亮度較低，顯著比球蛋白與醇溶蛋白的顏色深(P<0.05)。為避免色素對蛋白顏色的影響，采用活性炭對分級蛋白進行了脫色處理，脫色后4種分級蛋白紅褐色與黃色程度均有顯著下降，但清蛋白與谷蛋白的色澤仍顯著深于球蛋白與醇溶蛋白(P<0.05)，說明色素以外分級蛋白自身可能產生了顏色變化。

蛋白質的顏色變化可能由多酚氧化酶導致酶促褐變，美拉德反應、焦糖化作用、抗壞血酸氧化、多元酚氧化縮合導致非酶促褐變等原因產生。在室溫或室溫以下，酶促反應速率比非酶反應快[26]，但在室溫以上，隨著溫度的升高，酶逐漸失活使得酶促褐變失去作用，且此時的干燥溫度未達到焦糖化反應的反應溫度(135 ℃以上)，抗壞血酸氧化往往在人體內和果蔬發酵的過程中存在。蛋白在冷凍干燥條件下美拉德反應受到抑制顏色較淺，隨著溫度的升高反應劇烈褐變程度隨之變深。因此促進褐變程度的加深的重要原因極可能是蛋白質和還原糖產生非酶促褐變的美拉德反應[27]。結合蛋白色澤隨溫度的變化趨勢，可通過進一步分析分級蛋白結構與組成探究糖基化引發非酶褐變的可能機理。

2.2 RBP分級蛋白的糖基化分析

2.2.1 RBP及其分級蛋白糖基化存在性分析

圖3是RBP及其分級蛋白樣品在400～4 000 cm-1范圍內的FT-IR光譜圖。結果表明，RBP及其分級蛋白在1 600～1 700 cm-1和1 500～1 600 cm-1之間存在蛋白質的特征峰；在3 000～2 800 cm-1及1 400 cm-1存在糖類的特征吸收峰；在3 100～3 300 cm-1及1 156 cm-1附近存在糖基化反應發生的特征峰。可以推斷分級蛋白中存在糖基化反應。

圖3 RBP及其分級蛋白的FT-IR光譜

2.2.2 RBP分級蛋白糖基化結構的確定與信息分析

2.2.2.1 PAS分級蛋白糖基化結構位置的確定

PAS染色的原理為糖蛋白糖鏈上2個相鄰的羥基被氧化劑氧化為醛基，醛基可與被處理后的堿性品紅生成不溶性的紫紅色物質，可通過紫紅色物質是否生成判斷樣品中糖蛋白的存在。圖4是RBP分級蛋白的考馬斯亮藍電泳圖譜。通過將PAS染色結果與考馬斯亮藍電泳圖譜對比發現，分級蛋白的小分子區域處出現低分子質量的紅色條帶，4種分級蛋白均在10.77 ku附近出現紅色條帶，即為分級蛋白中的糖蛋白。

圖4 RBP分級蛋白的考馬斯亮藍電泳圖譜

2.2.2.2 RBP分級蛋白組成的LC-MS/MS鑒定

對電泳分離以及具有糖基化修飾的4種分級蛋白的10.77 ku條帶通過LC-MS/MS法鑒定，主要結果見表1。4種分級蛋白均含有與蛋白生理活動相關的酶類，組成存在一定差異，且均具有糖基化修飾的蛋白。其中球蛋白中具有糖類修飾的蛋白片段為63 ku球蛋白，醇溶蛋白則為Os05g0331800蛋白、Os05g0328800蛋白及Os05g0328632蛋白。這些蛋白的修飾糖類包括巖藻糖、己糖和庚糖。RBP分級蛋白的色度測定結果顯示，與球蛋白及醇溶蛋白相比，清蛋白和谷蛋白的顏色較深。進一步對蛋白褐變產生的原因進行推斷，得到：清蛋白由于新型蛋白酶中糖類的存在使其顏色較深。谷蛋白含有的A2型谷蛋白、17D醇溶蛋白、Os05g0328632蛋白及Os05g0331800蛋白片段中糖類物質的修飾以及修飾糖類種類較多，且因為谷蛋白為經堿液提取所得，已知RBP在堿性條件下，易發生水解變性，增加美拉德反應，產生深棕色物質[28]，這些原因都可能導致其顏色較深。

表1 分級蛋白電泳條帶和糖基化修飾的LC-MS/MS鑒定的主要結果

3 結論

在50、60、70、80、90 ℃溫度條件下烘干的RBP相對于冷凍干燥獲取的蛋白褐變程度更深。電泳分析證實RBP分級蛋白中且PAS染色圖譜中4種分級蛋白均在10.77 ku附近出現紅色條帶確定了糖基化修飾的存在。RBP及其分級蛋白樣品在400～4 000 cm-1范圍內的紅外圖譜中可見3 100～3 300 cm-1與115 6 cm-1存在糖基化反應特征峰。對4種分級蛋白的10.77 ku條帶進行LC-MS/MS分析，4種分級蛋白均具有糖基化修飾的蛋白得出4種分級蛋白均存在糖基化現象，且與球蛋白、醇溶蛋白相比，清蛋白和谷蛋白中糖基化修飾的糖類較多，可見己糖、庚糖、巖藻糖等糖基化修飾的發生。結果表明RBP的非酶褐變與其分級蛋白中的糖基化現象相關，且根據分級蛋白之間的顏色差異推測清蛋白與谷蛋白中某些蛋白片段的糖基化現象對蛋白褐變起重要作用。未來可通過對冷凍樣品進行電泳等分析并與烘干樣品對比，驗證RBP非酶褐變機理與糖基化現象之間更深層次的聯系。