miR-181c-5p通過靶向NDRG2調節人膠質母細胞瘤生物學活性

王鐵峰 王剛 牛占峰

(1海南省第二人民醫院神經外科，海南 五指山 572299；2寧夏醫科大學總醫院神經外科)

人膠質母細胞瘤是常見的人腦內原發性惡性腫瘤，具有極高的發病率和死亡率〔1〕。當前已有多種能夠治療膠質瘤的方法，如藥物治療、手術治療等，但仍具有一定的缺陷性，治療效果不佳〔2，3〕。MicroRNA是一種廣泛分布的內源性非編碼蛋白質的小RNAs(約為22個核苷酸)，其特點是可以結合到mRNA的3′UTR端來發揮其負調控基因表達的作用〔4〕?，F已證實，miRNA與腫瘤的發生發展具有緊密聯系〔5〕。已有研究表明，miRNA在膠質瘤細胞中具有差異性表達，并在細胞的增殖、遷移、凋亡中扮演重要角色。miR-128通過靶向ARP5/Bmi-1/E2F-3a從而調節膠質母細胞瘤的增殖〔6〕。miR-328通過靶向ABCG2降低膠質母細胞瘤的耐藥性〔7〕。miR-125a-5p通過靶向TAZ可抑制膠質母細胞瘤增殖并促進其進行分化〔8〕。miR-181c-5p也是miRNA家族中的一員，已有研究發現miR-181c-5p在多種疾病的發生中具有重要作用，LncRNA可通過miR-181c-5p競爭性結合從而調控巨噬細胞自噬〔9〕。miR-181c-5p通過調控白血病抑制因子從而調控高糖介導的人臍靜脈內皮細胞功能障礙〔10〕。miR-181c-5p通過靶向SMAD7調節神經母細胞瘤的生物學活性〔11〕。但miR-181c-5p在膠質母細胞瘤中的表達及其調控機制目前還不清楚。本研究擬分析miR-181c-5p在膠質瘤細胞中的表達及對其生物學活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質母細胞瘤細胞系U87購于美國ATCC公司；細胞培養基DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購于Sigma；脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物科技公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購于promega公司；NDRG2-3′UTR和NDRG2-3′UTR MUT由擎科生物有限公司設計；miR-181c-5p mimics及NC-mimics、 miR-181c-5p inhibitor及NC-inhibitor由上海吉瑪制藥公司設計并合成。CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物有限公司；Transwell孔板購于康寧；NDRG2、GAPDH等抗體購于碧云天生物。

1.2臨床樣本 從在醫院進行手術治療的膠質母細胞瘤患者中，收集30例神經膠質瘤組織樣本及鄰近的正常組織樣本。組織離體后在液氮中進行快速冷凍，在使用臨床樣本實驗前應對其進行蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定。本研究已獲得倫理委員會批準，并在取樣時得到了患者許可。

1.3細胞培養與轉染 人膠質母細胞瘤細胞系U87細胞在含有2.5%FBS、5%馬血清的DMEM-F12培養基中，在37℃，5%CO2條件培養。每3天進行一次換液。當細胞處于對數生長期時即可用于進行其他生物學實驗。

將處于對數生長期的U87細胞接種至6孔板中，每孔約2×105個細胞。然后使用轉染效率穩定的脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000進行轉染。根據實驗設計，miR-181c-5p mimics組、miR-181c-5p inhibitor組、NC-mimics組、NC-inhibitor組及對照組分別將miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor及相對應的陰性對照(NC-mimics、NC-inhibitor)及等量的脂質體轉染試劑分別轉入U87細胞中，轉染結束后在培養條件下進行72 h培養。

1.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據TRIzol Reagent 使用說明書操作提取人膠質母細胞瘤組織及U87細胞中的總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒使用說明書將RNA逆轉錄為cDNA。miR-181c-5p：上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAACA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；NDRG2：上游引物5′-CTGGAACAGCTACAACAACC-3′，下游引物5′-CCCCTCAGCTATAGACACCT-3′；GAPGH：上游引物5′-GGTGAAGGCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。按照說明書配制qRT-PCR體系，反應條件為95℃預變性30 s，40個循環擴增反應(95℃ 5 s，60℃ 20 s)。以GAPGH為NDRG2內參，U6為miR-181c-5p的內參，2-△△Ct法計算miR-181c-5p、NDRG2的相對表達。

1.5Western印跡檢測蛋白表達情況 使用組織/細胞裂解液對組織/細胞進行裂解，然后收集總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。分別取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉至聚偏氟乙烯(PDVF)膜上，然后使用5%脫脂奶粉對其進行1 h封閉，使用1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)將膜清洗3次。加入相應的一抗置于4℃搖床過夜孵育，清洗后，加入二抗進行室溫孵育1 h，清洗后加入ECL顯影液顯影。

1.6CCK-8檢測細胞增殖 鋪處于生長期的U87細胞至96孔板中，進行轉染后培養48 h，然后向每個孔中加入10 μl CCK-8試劑并混勻，并設置空白對照。37℃下避光孵育1 h，使用酶標儀測定波長450 nm的吸光度值。

1.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲 取處于生長期的U87細胞至24孔板中，進行轉染后培養48 h。使用胰酶消化U87細胞并用無血清培養基進行重懸，使用臺盼藍染色技術調整細胞密度為2×108/L，然后取細胞懸液100 μl加至Transwell小室上層向，Transwell小室下層中加入500 μl 10%血清完全培養基，37℃培養箱中避光培養24 h后取出小室，1倍PBS清洗后用棉簽輕輕擦除上室中未發生遷移的細胞。用4%多聚甲醛固定20 min，1倍PBS清洗3次后使用0.1%結晶紫染色10 min，1倍PBS清洗后，隨機選擇5個視野，計數下室染色細胞。

將提前凍存的基質膠置于4℃直至溶成液態，使用400 μl無血清培養基對50 μl基質膠原液進行稀釋并輕輕搖晃混勻。取50 μl稀釋液加至Transwell小室的上室中，置于37℃培養箱中進行孵育，當凝固后加入100 μl無血清培養基浸潤凝膠，吸棄，后續步驟與遷移實驗相同。通過計數穿膜細胞數來反映細胞侵襲能力。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 取處于生長期的U87細胞至24孔板中，進行轉染后培養48 h。使用不含EDTA的胰酶消化U87細胞并用無血清培養基進行重懸。1 000 r/min離心5 min，收集細胞，加入500 μl 1倍結合緩沖液對細胞進行重懸，再加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI并輕輕搖晃混勻，室溫避光5 min后使用流式細胞術統計各組凋亡率。

1.9生物信息學預測miR-181c-5p的靶基因 通過生物信息學網站miRBD和targetscan聯合預測miR-181c-5p的靶基因。

1.10雙熒光素酶報告實驗 取GIST-T1細胞制備成單細胞懸液，接種于96孔板，采用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000按說明書操作進行共轉染，然后將細胞分為4組：野生型質粒對照組(轉染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR)、野生型實驗組(轉染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR)、突變型質粒對照組(轉染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR MUT)、突變型質粒實驗組(轉染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR MUT)。對其培養24 h后裂解細胞，并按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.11統計學方法 采用GRAPDprism6.0統計學軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1miR-181c-5p在膠質瘤組織中的表達 與正常組織(0.88±0.13)相比，神經膠質瘤組織中的miR-181c-5p(1.80±0.20)顯著上調(P<0.01)。

2.2miR-181c-5p可以調控膠質母細胞瘤的生物學功能 與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞中miR-181c-5p顯著增加(P<0.001)，而NC mimics組與對照組無明顯差異(P<0.05)。與對照組相比，miR-181c-5p inhibitor組中miR-181c-5p表達顯著降低(P<0.001)。見表1。

CCK-8實驗結果顯示，與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞吸光度顯著增加(P<0.01)，而NC-mimics組與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)；與對照組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細胞吸光度顯著下降(P<0.05)，而NC-inhibitor與對照組無明顯差異(P>0.05)。

Transwell細胞遷移實驗顯示，與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞遷移率、侵襲率顯著上升(P<0.01,P<0.05)，而NC組與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)；與對照組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細胞遷移率、侵襲率顯著下降，而NC-inhibitor與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)。見表1、圖1、圖2。與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞凋亡率下降(P<0.01)，而NC-mimics組與對照組沒有差異性(P>0.05)；與NC-inhibitor組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細胞凋亡率增加(P<0.01)，而NC-inhibitor與對照組沒有差異性(P>0.05)。見表1、圖3。

圖1 細胞遷移實驗(結晶紫染色，×40)

圖2 細胞侵襲實驗(結晶紫染色，×40)

圖3 流式細胞術檢測U87細胞凋亡

表1 miR-181c-5p可調控膠質瘤細胞U87的生物學活性

2.3miR-181c-5p的靶基因 通過生物信息學在線分析軟件miRbase和Targetscan預測miR-181c-5p的靶基因，結果顯示NDRG2可能是miR-181c-5p的靶基因，存在互補的結合位點(圖4)。通過雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-181c-5p mimics組NDRG2 3′UTR的相對熒光素酶活性明顯受到抑制，而NDRG2 3′UTR MUT的相對熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用。見表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗分析miR-181c-5p與NDRG2間的靶向結合作用

圖4 miR-181c-5p與NDRG2間的結合序列

2.4miR-181c-5p對NDRG2基因的表達調控 與對照組相比，U87細胞中轉染miR-181c-5p mimics后可顯著下調NDRG2 mRNA表達和蛋白表達。而NC-mimics組與對照組沒有差異性(P>0.05)；與對照組組相比，U87細胞中轉染miR-181c-5p-inhibitor可上調NDRG2 mRNA表達和蛋白表達，而NC-inhibitor與對照組沒有差異性(P>0.05)。見圖5、表3。

圖5 Western印跡檢測NDRG2蛋白表達

表3 qRT-PCR檢測miR-181c-5p mimics、NC-mimics轉染后NDRG2 mRNA表達

3 討 論

人膠質母細胞瘤是常見的腦部惡性腫瘤之一，其復發性高，死亡率高。已通過分子生物學、遺傳學、病理學等方法的結合對其進行了探究，為臨床治療該疾病提供了許多價值資料。

miRNA是一種約22個核苷酸組成的內源性非編碼蛋白質的小RNAs，與腫瘤的發生發展具有密切關系〔12〕。能夠通過與靶基因的mRNA 3′UTR區域直接結合進而調控腫瘤發生中的生物學活性，如細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、細胞凋亡等〔13，14〕。研究表明，多種miRNA在GSM發生發展中更具有重要作用，如miR-181d〔15〕、miRNA-154-5p〔16〕、miR-21〔17〕、miR-429〔18〕等。本研究與前期研究結果一致〔19〕，表明miR-181c-5p在膠質母細胞瘤發生發展過程中具有重要作用。在U87細胞中進一步通過實驗證實，miR-181c-5p的表達可促進細胞增殖、遷移及侵襲且抑制細胞凋亡。通過生物信息學在線分析網站預測出NDRG2是miR-181c-5p的靶基因，能夠與NDRG2 3′UTR區域結合而影響生物學活性。并通過雙熒光素酶實驗證實miR-181c-5p可以直接結合NDRG2 3′UTR區域且這種結合是靶向抑制的。研究表明NDRG2作為NDRG家族的重要成員，在參與組織胚胎發育、細胞分化及血液免疫中具有重要作用，同時也與腫瘤的發生密切相關〔11，20～24〕。Deng等〔25〕研究表明在膠質瘤中NDRG2表達下調，與本研究結果一致。

綜上，miR-181c-5p通過靶向抑制NDRG2的表達，進而調節人膠質細胞瘤的生物學活性。miR-181c-5p成為治療膠質母細胞瘤的潛在靶點。