金雀異黃素對大鼠雪旺細胞生長與凋亡影響的體外研究

段曉英 杜珍武 丁宏 楊忠影 曹振強

(吉林大學第二醫院，吉林 長春 130022)

金雀異黃素(Gen)又稱金雀異黃酮、染料木黃素、染料木黃酮、4′，5，7-三羥基異黃酮，是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮類化合物。Gen是強力酪氨酸蛋白激酶的抑制劑和拓撲異構酶Ⅱ抑制劑。它具有廣泛的抗腫瘤藥理活性，能通過多種途徑抑制腫瘤的生長和轉移，誘導腫瘤細胞凋亡〔1～4〕。同時，Gen也是一種理想的抗氧化劑，它可以清除活性氧自由基，降低脂質過氧化產物，誘導提高抗氧化酶活性水平。研究表明，Gen的抗氧化機制可以抑制大腦神經元細胞的氧化應激損傷，從而起到保護中樞神經的作用〔5～8〕。雪旺細胞(SCs)是周圍神經系統中特有的膠質細胞，是髓鞘形成的功能細胞，在維持神經結構及神經損傷修復過程中起著重要作用。如何保護SCs是周圍神經損傷修復過程中的關鍵。對Gen的周圍神經保護作用〔9〕報道較少，因此本研究擬在體外細胞模型探討Gen對SCs生長的影響及其相關機制，為Gen在周圍神經細胞保護中應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1大鼠SCs培養 RSC96大鼠SCs購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。將RSC96細胞培養于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃，5%二氧化碳培養箱內培養。

1.2細胞活性測定 Gen溶于二甲基亞砜(DMSO)。將RSC96的細胞以2 000/孔細胞數接種于96孔細胞培養板，培養基內加入不同濃度的Gen，其濃度分別為4.625 μmol/L，9.250 μmol/L，18.500 μmol/L，37.000 μmol/L，74.000 μmol/L，148.000 μmol/L。同時設對照組(不加藥)及DMSO組。培養24 h后，每孔加入CCK-8(北京天恩澤) 10 μl，作用1 h后，應用酶標儀在450 nm處進行OD值檢測。之后，每隔24 h檢測1次，共檢測5次。同時應用倒置顯微鏡(德國徠卡)進行細胞生長的形態學觀察。

1.3細胞周期檢測 以1×105/瓶細胞數將RSC96細胞接種于25 cm2細胞培養瓶，分為Gen 74.000 μmol/L組、對照組、DMSO組，每組3瓶。培養24 h后，胰酶消化細胞，吸取細胞消化液，1 200 r/min離心5 min，沉淀細胞。加入1 ml冰浴預冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃固定。12 h后1 200 r/min離心5 min，沉淀細胞，棄上清，加入1 ml預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，重懸細胞，離心沉淀細胞，吸除上清。加入碘化丙啶染色液(碧云天試劑)，37℃避光溫浴30 min。用流式細胞儀在激發波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

1.4細胞凋亡的熒光染色檢測 RSC96細胞以1×104/孔細胞數接種于24孔細胞培養板，加入濃度為37.000 μmol/L及74.000 μmol/L的Gen，同時設對照組(不加藥)。藥物作用24 h后，應用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術，C1062S)進行細胞凋亡檢測。具體方法：吸除細胞培養液，加入PBS洗滌1次，加入195 μl Annexin V-FITC結合液。加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育20 min，隨后置于冰浴中。在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光。隨機拍照5個視野，分別計數染色細胞及總細胞數，計算染色細胞的百分比。

1.5基因表達檢測 RSC96細胞以1×106/孔細胞數接種于6孔細胞培養板，分別加入74.000 μmol/L Gen與4 μl DMSO，藥物作用24 h后，收集細胞，加入Trizol(Invitrogen)裂解細胞，通過氯仿抽提、異丙醇沉淀及70%乙醇純化獲取細胞總RNA，獲得RNA通過凝膠電泳觀察完整性，通過紫外測定260 nm與280 nm OD值評價提取RNA質量與純度。 取1 μg提取的總RNA，應用cDNA合成試劑盒(大連寶生物)進行逆轉錄，合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，實時定量PCR檢測大鼠B細胞淋巴瘤/白血病(BCL)2、胱天蛋白酶(CASP)3、腫瘤蛋白P53(TP53)、細胞周期素依賴性激酶抑制劑(CDKN)1B、CDKN1A的表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參基因。各基因表達檢測引物：BCL2：上游：CCGGGAGAACAGGGTATGATAA，下游：CCCACTCGTAGCCCCTCTG；CASP3：上游：GGAGCTTGGAACGCGAAGAA，下游：ACACAAGCCCATTTCAGGGT；TP53：上游：TACTTCCCAGCAGGGTGTCA，下游：ACACTTGGAGGGCTTCCTCT；CDKN1A：上游：GGGATGCATCTATCTTGTGATATGT，下游：CGAACAGACGACGGCATACT；CDKN1B：上游：TCGACGCCAGACGTAAACAG，下游：CGCAATGCTACATCCAATGCT，內參基因GAPDH：上游：TAGACAAGATGGTGAAGGTCGG，下游：CTTGACTGTGCCGTTGAACTTG。

2 結 果

2.1Gen對RSC96細胞周期的影響 Gen 37.000 μmol/L組RSC96細胞處在G2/M期細胞比例明顯多于對照組(P<0.05)，而G1期細胞比例明顯減少，明顯少于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞周期比較

2.2Gen對大鼠RSC96細胞生長的影響 Gen 37.000 μmol/L組RSC96細胞活性在72 h及96 h明顯低于對照組(P<0.05)。Gen 74.000 μmol/L組及148.000 μmol/L組，從24 h開始直到120 h細胞活性均明顯低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表2。細胞形態學觀察結果顯示Gen 37.000 μmol/L組、74.000 μmol/L及148.000 μmol/L組72 h細胞數目較對照組明顯減少。見圖1。

表2 各組培養不同時間細胞活性比較

圖1 Gen作用大鼠RSC96細胞72 h倒置顯微鏡形態學(×100)

2.3Gen誘導大鼠RSC96細胞凋亡 與對照組〔(1.561±0.381)%〕相比，Gen 37.000 μmol/L組凋亡細胞數〔(2.827±0.641)%〕有所增多，但差異無統計學意義(P>0.05);Gen 74.000 μmol/L組凋亡細胞數〔(34.458±4.351)%〕顯著增多,明顯高于對照組和Gen 37.000 μmol/L組(均P<0.01)。見圖2。

圖2 Gen作用大鼠RSC96細胞24 h后細胞凋亡(×100)

2.4Gen對RSC96細胞生長相關基因表達影響 與DMSO組相比，Gen 74.000 μmol/L組作用24 h后，CDKN1A基因表達明顯升高，其余基因表達無變化。見表3。

表3 各組CASP3、BCL2、CDKN1B、CDKN1A及TP53 mRNA表達比較

3 討 論

在我國，中老年糖尿病的發病率逐年升高。糖尿病周圍神經病變(DPN)是最常見、最復雜的并發癥之一，其中70%～80%的中老年糖尿病患者都會出現感覺和運動神經損傷，嚴重影響了患者的生活質量，甚至影響生存。SCs是周圍神經修復過程中最關鍵的構建細胞，它對于髓鞘的生成、營養神經元和支持神經結構都起著至關重要的作用。已有研究表明，Gen可以改善糖尿病小鼠神經生長因子含量和血管功能障礙〔10〕，還可以逆轉周圍神經損傷后的疼痛過敏反應，可能與Gen發揮其抗氧化性有關〔11〕。本研究說明37.000 μmol/L Gen減緩RSC96細胞生長；細胞周期抑制蛋白可能在抑制RSC96細胞生長方面發揮作用。研究報道Gen作為酪氨酸激酶抑制劑，對SCs增殖分化，髓鞘形成產生影響〔12,13〕，可見Gen對RSC96細胞的抑制作用通過多種途徑完成，并存在劑量依賴性。同時，本課題組還要進一步實驗驗證Gen能否對病理條件下氧化損傷的RSC96細胞有影響及其作用的相關濃度分析。總之，本研究在體外細胞水平闡明Gen能夠抑制大鼠SCs增殖，初步分析了其機制，對Gen的治療選擇及劑量應用具有一定借鑒意義。