miR-654靶向FHIT對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其機制

郭麗 趙虹 張俊濤 劉志貞 弓韜 梁文婷 劉暢 孫公勤 于保鋒

(1臨汾職業技術學院，山西 臨汾 041000；2山西醫科大學生物化學與分子生物學教研室；3山西大學環境科學研究所)

原發性肝癌是世界常見高發惡性腫瘤，進展快、預后差，其治療方法包括肝切除術和肝移植術，但多數患者發現時已是晚期，難治愈；探尋新的有效治療藥物及手段對肝癌治療有重要意義，分子靶向治療為肝癌的治療提供了新的手段〔1,2〕。microRNA(miR)是一類僅有20～24 nt核苷酸的小RNA分子，可在轉錄后調控靶基因，且可影響肝癌細胞的惡性病理過程〔3〕。研究發現miR-654-3p可能調節轉移性前列腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲〔4〕。miR-654-5p通過抑制骨形態發生蛋白(BMP)2調控人骨髓基質干細胞成骨分化〔5〕。有研究發現miR-654在肝癌中上調表達，但目前miR-654對肝癌生物學行為的影響還不清楚。脆性組氨酸三聯體(FHIT)定位于染色體3p14.2，是一個腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤及肝癌中表達減少和缺失〔6〕。研究報道過表達FHIT可誘導肝癌細胞凋亡并導致其發生G1期阻滯從而抑制腫瘤細胞生長〔7〕。本實驗通過轉染miR-654和FHIT的抑制表達載體至肝癌細胞HepG2中，研究其對肝癌細胞的影響；同時研究miR-654和FHIT之間的靶向關系，旨在研究miR-654對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及其機制是否與FHIT有關。

1 材料與方法

1.1患者組織和肝癌細胞來源 選取山西醫科大學附屬山西白求恩醫院收治的肝癌患者，手術取其肝癌組織和癌旁組織，所有患者術前未進行放化療，均知情同意。肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑 RPMI1640培養基購自武漢益普生物公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海撫生實業有限公司；RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、鈣黏附蛋白(E-cadherin)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、FHIT、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物科技有限公司；Transwell小室、基質膠購自上海代軒生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養與分組 肝癌細胞HepG2用RPMI-1640培養基培養，取對數生長期細胞，將miR-654抑制劑及陰性對照轉染至HepG2細胞，計為anti-miR-654組、anti-miR-NC組；將miR-654抑制劑分別與FHIT干擾載體及陰性對照共轉染至HepG2細胞，計為anti-miR-654+si-FHIT組、anti-miR-654+si-NC組。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-654表達水平 取適量肝癌組織、癌旁組織及收集anti-miR-NC組、anti-miR-654組的HepG2細胞，加入Trizol試劑提取其總RNA，合成cDNA后U6為內參進行PCR，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.3.3MTT檢測細胞增殖活性 anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細胞培養至24 h、48 h、72 h時，分別加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后加入150 μl二甲基亞砜，振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞后用結合緩沖液進行重懸；然后加入Annexin V-FITC和PI，反應后上流式細胞儀檢測。

1.3.5Western印跡檢測蛋白表達水平 收集anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細胞，提取總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉；加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值。

1.3.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 取anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細胞，用無血清培養液重懸，取200 μl細胞懸液接種于Transwell上室，下室加入含趨化因子的培養液，置于培養箱中培養24 h，棄去培養液，將細胞用4%多聚甲醛固定30 min，再加入結晶紫染色，漂洗干燥，用顯微鏡拍照并計數，即為遷移細胞數。侵襲實驗用基質膠平鋪覆蓋Transwell上室，然后同遷移操作。

1.3.7熒光素酶報告實驗 將FHIT 野生型和突變型熒光素酶表達載體(WT-FHIT和MUT-FHIT)分別與miR-NC和miR-654共轉染至HepG2細胞中，依據說明書要求操作，檢測熒光素酶活性。將anti-miR-NC、anti-miR-654、miR-NC、miR-654分別轉染至HepG2細胞中，用Western印跡檢測FHIT蛋白表達水平。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-654在肝癌組織中的表達 肝癌組織中miR-654表達水平(0.78±0.12)顯著高于癌旁組織(0.18±0.03，P<0.05)。

2.2抑制miR-654對細胞HepG2增殖、凋亡的影響 轉染anti-miR-NC、anti-miR-654后，anti-miR-654組miR-654的表達水平顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明轉染成功；anti-miR-654組48及72 h細胞活性及CyclinD1、Bcl-2表達水平顯著低于anti-miR-NC組，而細胞凋亡率和p21、Bax表達水平顯著高于anti-miR-NC組(均P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

圖1 抑制miR-654對細胞HepG2凋亡的影響

1～2：anti-miR-NC組，anti-miR-645組圖2 抑制miR-654對細胞HepG2增殖、凋亡蛋白表達的影響

表1 抑制miR-654對細胞增殖凋亡的影響

2.3抑制miR-654對細胞HepG2遷移、侵襲的影響 anti-miR-654組HepG2細胞的遷移和侵襲數目、MMP-2表達水平均顯著低于anti-miR-NC組，而E-cadherin的表達水平顯著高于anti-miR-NC組(均P<0.05)，見圖3，表2。

1～2:anti-miR-NC組，anti-miR-654組圖3 抑制miR-654對遷移、侵襲蛋白E-cadherin和MMP-2表達的影響

表2 抑制miR-654對細胞遷移侵襲的影響

2.4miR-654靶向、調控FHIT TargetScan預測顯示FHIT與miR-654存在結合位點。見圖4。WT-FHIT與miR-654共轉染后HepG2細胞的熒光素酶活性顯著低于WT-FHIT與miR-NC共轉染的細胞(P<0.05)，見表3。miR-654組FHIT表達水平(0.08±0.01)顯著低于miR-NC組(0.25±0.03，P<0.05)；anti-miR-654組FHIT表達水平(0.67±0.05)顯著高于anti-miR-NC組(0.23±0.02，P<0.05)。見圖5。

圖4 FHIT與miR-654的互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

1,2：miR-NC組，miR-654組圖5 FHIT蛋白的表達水平

2.5抑制FHIT能逆轉抑制miR-654對細胞HepG2增殖、凋亡的作用 anti-miR-654+si-FHIT組48及72 h細胞活性及CyclinD1、Bcl-2表達水平顯著高于anti-miR-654+si-NC組，而細胞凋亡率及FHIT、p21、Bax表達水平顯著低于anti-miR-654+si-NC組(均P<0.05)，見圖6、表4。

1，2：anti-miR-654+si-NC,anti-miR-654+si-FHIT組圖6 抑制FHIT能逆轉抑制miR-654對細胞HepG2增殖、凋亡蛋白表達的影響

表4 抑制FHIT能逆轉抑制miR-654對細胞增殖凋亡的作用

2.6抑制FHIT能逆轉抑制miR-654對細胞HepG2遷移、侵襲的作用 anti-miR-654+si-FHIT組HepG2細胞遷移和侵襲數目及MMP-2表達水平顯著高于anti-miR-654+si-NC組，E-cadherin表達水平顯著低于anti-miR-654+si-NC組(均P<0.05)，見表5、圖7。

表5 抑制FHIT能逆轉抑制miR-654對細胞遷移侵襲的作用

1～2:anti-miR-654+si-NC組,anti-miR-654+si-FHIT組圖7 抑制FHIT和miR-654對細胞HepG2遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

肝癌有惡性程度高、起病隱匿、進展快等特點，術后復發率高〔8〕。研究發現miRNA與肝癌的發生發展密切相關，可作為診斷、預后的生物標志物及治療靶點〔9，10〕。有研究報道miR-654-5p在乳腺癌組織和細胞系中下調表達，其低表達與晚期TNM分期和淋巴結轉移密切相關，miR-654-5p過表達通過靶向上皮基質相互作用(EPSTI)1基因抑制細胞生長和侵襲，并誘導乳腺癌細胞凋亡〔11〕。miR-654-5p在晚期口腔鱗狀細胞癌(OSCC)患者中上調并且與OSCC患者的不良預后相關；可促進OSCC的增殖，轉移〔12〕。本研究結果表明抑制miR-654可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，而促進細胞凋亡。

CyclinD1和p21均是細胞周期相關蛋白，CyclinD1高表達可導致細胞過度增殖促進腫瘤的發生，p21是抑癌基因，可抑制細胞的異常生長〔13〕。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的關鍵因子，Bax促凋亡，Bcl-2抑凋亡。E-cadherin主要維持細胞間的黏附作用，其下調表達細胞間黏附性降低；MMP-2與細胞的侵襲轉移密切相關〔14〕。本研究結果說明抑制miR-654表達可通過調控相關蛋白的表達進而影響肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。

目前，FHIT廣泛被認為是一種抑癌基因蛋白，能誘導細胞凋亡，抑制細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞增殖，異常低表達與多種腫瘤進展相關〔15〕。FHIT在原發性肝癌中低表達，參與了肝癌細胞的增殖與凋亡調控過程〔16〕。轉染FHIT可增強人肝癌細胞HepG2輻射敏感性〔17〕。FHIT還可誘導肺癌自噬促進細胞凋亡〔18〕。

綜上，抑制miR-654表達可能通過調控FHIT表達抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。