益氣除痰方聯合CTL免疫過繼療法對肺癌A549細胞生長的抑制

李雪松 周迎春 李婳婳 李溪

(1廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院)

國家癌癥中心發布的2015年統計數據顯示，當今肺癌發病率與死亡率均居我國惡性腫瘤的首位〔1〕，其中非小細胞肺癌占臨床肺癌患者的80%～90%。由于早期診斷困難，且缺乏有效的治療措施，癌癥患者總體預后較差。益氣除痰方是由廣州中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科所創制的治療肺癌的經驗方，前期研究表明，益氣除痰方在臨床治療中具有良好療效〔2，3〕。近年來，基于免疫細胞在惡性腫瘤治療方面的巨大潛力，免疫細胞過繼療法已成為繼手術、放療和化療之外的一種新的治療方法〔4〕。同時，傳統中醫藥聯合細胞治療的方法也被越來越多的實驗研究所證實。本文擬探究益氣除痰方聯合細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對肺腺癌A549細胞生長的影響。

1 資料與方法

1.1細胞株 人源性肺腺癌A549細胞由廣州中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科惠贈。A549細胞中加入含10%胎牛血清(FBS)RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2培養箱飽和濕度下培養、傳代，待細胞呈貼壁生長，于細胞對數生長期開始實驗。

1.2藥物 西洋參、法半夏、浙貝、山慈菇、茯苓等均購自廣州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經鑒定均為正品。

1.3動物 SPF及SD雌性大鼠20只，體重200～220 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0020。

1.4主要試劑 DMEM高糖培養基(Thermo公司，批號：NZ3422)，RPMI1640(Gibco公司，批號：D6429)，FBS(Corning公司，批號：C11875)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Corning公司，批號：210-040-cvc)，青鏈霉素(Penicillin G/sterptomycin，Gibco公司，批號：FBSSA500-S)，重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、重組人白細胞介素(IL)-4蛋白(近岸蛋白質科技有限公司，批號：0331243/0331322)、Anti-Human CD3PE-Cy5、Anti-Human CD8a FITC、Anti-Human CD28PE、Anti-Human CD86PE、Anti-Human CD11c APC(BioGems公司，批號：05131-65-100、10131-50-100、10311-60-100、02911-50-100、03231-80-100)。

1.5主要儀器 Herocell 240型CO2細胞培養箱(RADOBIO公司)，Mini型蛋白電泳系統(Bio-rad公司)，冷凍高速離心機(Microfuge 20R，美國Beckman Coulter公司)，RT-6000自動酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)，倒置熒光顯微鏡(Ti2-U)(日本Nikon公司)，流式細胞儀(Cell Lab Quanta SC)(美國Beckman Coulter公司)。

1.6含藥血清的制備 益氣除痰方水煎煮2次。第1次8倍水提取1 h，第2次6倍水提取1 h，200目篩過濾，合并濾液后放入真空干燥打粉即得益氣除痰方凍干粉，密封干燥保存。1 g凍干粉相當于5.12 g生藥。臨用前加入0.5%羧甲基纖維素鈉促溶，使用PBS調至所需濃度。大鼠灌胃生藥量為每天63 g/kg，以2.08 g/ml藥物濃度灌胃，2次/d，連續6 d，末次給藥1 h后腹主動脈取血，4℃冰箱靜置2 h后3 000 r/min，離心15 min后分離血清，56℃水浴箱滅活血清30 min，0.22 μm濾膜除菌，分裝于1.5 ml EP管，于-20℃冰箱保存備用。

1.7樹突細胞制備 用密度梯度離心法經Ficoll淋巴細胞分離液從健康成人外周血中分離單個核細胞，接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中24 h，培養瓶中的細胞分為貼壁細胞與非貼壁細胞，吸取非貼壁細胞即外周血淋巴細胞(PBLs)到另一培養瓶中，貼壁細胞即為外周血單個核細胞(PBMCs)。加入含有25 ng/ml GM-CSF、50 ng/ml IL-4和10%FBS的RPMI1640完全培養基，每隔3 d半量換液1次。

1.8腫瘤全抗原制備 肺癌A549細胞株在RPMI1640培養基中培養、傳代，消化收集對數生長期細胞，經離心洗滌后封裝入1.5 ml凍存管中，放入液氮內10 min后，馬上取出置入60℃水浴箱中10 min，該凍融步驟共重復3次，隨后將其放入離心機中12 000 r/min離心20 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，所得液體即為腫瘤相關抗原；后利用二喹啉甲酸(BCA)法測定腫瘤抗原濃度，取定濃度為100 μg/ml。

1.9CTL細胞的培養 將1.7中的非貼壁細胞(即T細胞)連同培養液一起吸入T75的培養瓶中，加入含有25 ng/ml IL-2的RPMI1640完全培養基，放置于37℃、5%CO2的培養箱中進行培養，每3天半量換液1次; 將體外培養5 d的T細胞與上述負載腫瘤抗原的成熟DCs進行混合共培養，T細胞∶樹突細胞=10∶1，加入IL-2 25 ng/ml，每3天半量換液1次，共培養7 d，形成腫瘤特異性細胞毒性T細胞。

1.10顯微鏡下觀察A549細胞形態 將處于對數生長期的A549細胞，按照1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，將6孔板置于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜，第2天用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細胞、30%益氣除痰方含藥血清聯合CTL細胞分別處理A549細胞株48 h，后于顯微鏡下觀察各處理組A549細胞的細胞形態變化。

1.11Transwell實驗檢測侵襲能力 將稀釋后的Matrigel基質膠鋪在Transwell小室上室面，24孔板每孔40 μl，置于培養箱中過夜。用胰酶消化與分離不同處理組處理48 h后的A549細胞并計數，濃度為3×105/ml，取200 μl鋪于Transwell小室上室面；24孔板的下室面加入600 μl含10%FBS的DMEM完全培養基；24 h后，用棉簽擦去Matrigel基質膠和上室內的培養液以及未穿過基質膠的細胞。將小室放入加有4%多聚甲醛的燒杯里固定20 min。20 min后，將小室放入染色0.1%結晶紫染液中，染色20 min，后清洗干凈染液并于通風處晾干，倒置顯微鏡下拍照，每孔拍3張100倍典型視野，取平均數作為該孔的穿膜細胞數。

1.12Transwell實驗檢測遷移能力 實驗步驟同1.11，僅無需鋪置Matrigel基質膠。

1.13PI單染流式細胞術測定細胞周期 取對數生長期細胞接種于6孔板中，培養12 h待細胞貼壁后，用無血清RPMI1640培養液繼續培養24 h，各組進行處理，每組設5個平行孔，制成單細胞懸液，800 r/min，離心5 min，沉淀細胞；加入1 ml PBS充分重懸成單細胞，輕輕邊渦旋邊緩慢滴加3 ml預冷的無水乙醇，至終濃度75%，4℃靜置過夜。取出固定細胞，用PBS洗滌2次，加入500 μl染色工作液，37℃避光溫浴30 min，300目篩網過濾后流式細胞儀進行檢測，采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

1.14AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 各組對A549細胞進行共培養處理，收集對數生長期的細胞。1 ml預冷的PBS共洗滌2次，于細胞沉淀中加入1倍結合緩沖液工作液，重懸細胞，使細胞濃度達到1×106/ml。取100 μl細胞懸液到一EP管中，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min；染色孵育后，每管加入400 μl 1倍結合緩沖液工作液，混勻后使用流式細胞儀檢測。結果用Cell Quest軟件進行分析。

1.15統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1樹突細胞培養 不成熟的樹突細胞在細胞因子的誘導下逐漸成熟，鏡下觀察，樹突細胞表面有毛刺狀突起，呈懸浮狀態生長，見圖1。

圖1 樹突細胞倒置顯微鏡下形態(×100)

2.2CTL細胞培養 流式細胞術測定經IL-2因子誘導，并與負載腫瘤抗原的樹突細胞共培養后，CD3+CD8+CD28+細胞的比例增高，鏡下觀察細胞體積變大，見圖2。

圖2 CTL細胞倒置顯微鏡下形態(×100)

2.3顯微鏡觀察各組A549細胞形態 當A549細胞經各組處理后，鏡下觀察到，30%空白血清組細胞生長狀態良好，呈典型的鋪路石樣，細胞之間鏈接緊密，胞體飽滿；30%益氣除痰方含藥血清組及CTL細胞組細胞變細邊長，呈長梭形，細胞間距變大；聯合組細胞不完整，胞膜破損，見圖3。

圖3 各處理組A549細胞顯微鏡下形態(×200)

2.4各組細胞侵襲能力比較 當分別用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細胞、30%益氣除痰方含藥血清+CTL細胞處理A549細胞后，A549細胞株侵襲細胞數分別為(1 067.22±27.50)、(556.00±15.93)、(748.45±16.85)、(338.67±11.85)個，與30%空白血清組相比，其余3個處理組侵襲細胞數目明顯減少(P<0.001)；且聯合組細胞侵襲數目最少，相較于30%益氣除痰方含藥血清組與CTL細胞組差異有統計學意義(P<0.001)，見圖4。

圖4 各處理組A549細胞侵襲(結晶紫，×100)

2.5各組細胞遷移能力比較 當分別用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細胞、30%益氣除痰方含藥血清+CTL細胞處理A549細胞后，A549細胞株遷移細胞數分別為(1469.78±8.03)、(651.00±10.40)、(735.33±7.23)、(350.22±16.32)個；與30%空白血清組相比，其余3個處理組侵襲細胞數目明顯減少，差異有統計學意義(P<0.001)；且聯合組遷移細胞數目最少，與30%益氣除痰方含藥血清組和CTL細胞組相比差異有統計學意義(P<0.001)，見圖5。

圖5 各處理組A549細胞遷移(結晶紫，×100)

2.6流式細胞術測定各處理組對A549細胞周期的影響 各處理組能夠誘導肺腺癌A549細胞株阻滯于G0/G1期，各處理組相較于30%空白血清組，G0/G1期面積表現為不同程度的增大，其中30%益氣除痰方含藥血清組最明顯，有(61.53±2.45)%細胞阻滯于G0/G1期；聯合組比例為(55.51±0.82)%分布于G0/G1期，相較于30%空白血清組的(49.22±1.61)%差異有統計學意義(P<0.001，P<0.05)，CTL細胞組有(54.68±4.14)%分布于G0/G1期，與30%空白血清組差異無統計學意義(P>0.05)；對于S期，4個處理組的分布比例分別為(24.28±1.95)、(19.60±0.28)、(25.46±1.83)、(29.68±1.46)，30%益氣除痰方含藥血清組S期細胞分布比例最小，聯合組比例最大，與30%空白血清組相比差異有統計學意義(P<0.01)；對于G2/M期，30%益氣除痰方含藥血清組分布比例最大(12.71±0.17)%，相比30%空白血清組(10.48±0.96)%差異有統計學意義(P<0.01)；CTL細胞組與聯合組細胞分布比例小于30%空白血清組，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.001)，見圖6。

圖6 各處理組對細胞周期的影響

2.7流式細胞術檢測各處理組A549細胞凋亡率 當分別用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細胞、聯合(30%益氣除痰方含藥血清+CTL細胞)處理A549細胞后，各處理組的細胞凋亡率分別為(4.92±1.85)%、(22.61±1.88)%、(31.60±1.00)%、(44.20±2.75)%，與30%空白血清組相比，其余各處理組的細胞凋亡率顯著上升(P<0.001)；30%益氣除痰方含藥血清組細胞凋亡率顯著低于CTL細胞組(P<0.001)；聯合組的細胞凋亡率最高，與30%益氣除痰方含藥血清組、CTL細胞組相比差異有統計學意義(P<0.001)，見圖7。

圖7 各處理組對細胞凋亡率的影響

3 討 論

肺癌在中醫古籍見于“肺積”“息賁”“肺癰”“勞嗽”等疾病。中醫學認為肺脾兩臟在氣的生成及津液循行等方面關系密切，肺癌發病不離肺脾，肺脾氣虛或氣機不暢，均可使痰濁內生，聚而成積；肺主宣發、通百脈，痰濁郁結于肺，常表現為氣郁痰瘀互結。故肺癌之治療，既離不開除痰、解毒，祛邪以扶正；也離不開益氣、健脾，扶正以祛邪。益氣除痰方作為我院治療腫瘤的經驗方，以補氣健脾、除痰通瘀為主治，在改善臨床癥狀、穩定病灶、提高患者生存質量和延長生存期以及對化療增效減毒等方面均顯示了一定的作用。前期基礎實驗研究中，進一步證實了益氣除痰方能夠抑制血管新生、增強免疫功能、提高化療敏感性等〔5～7〕。近年來，免疫細胞過繼治療腫瘤成為廣大學者研究的熱點。Rohaan等〔8〕進一步提出免疫細胞過繼療法在腫瘤治療方面的廣闊前景。因此，益氣除痰方扶正祛邪的功用，配合CTL免疫細胞過繼療法增強免疫的效能，兩者相輔相成，可能進一步提高殺傷腫瘤的作用，目前已有類似研究報道〔9〕。

本研究結果表明，益氣除痰方聯合CTL細胞對肺腺癌細胞的生長影響最為顯著，可以明顯抑制細胞的生長、侵襲與遷移能力，提高凋亡率，影響細胞的分裂與增殖情況。