新疆吐魯番及阿勒泰主要奶牛產區環形泰勒蟲PCR檢測及Tams1基因分析

李才善 ， 郭子涵 ， 陳宋琴 ， 馬 英 ， 祖力亞·克力木江 ， 劉一凡 ， 李盈科 ， 郭慶勇

(新疆農業大學動物醫學學院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

環形泰勒蟲病(Theileriosis)是一種由環形泰勒蟲(Theileriaannulata)引起的血液性原蟲病，該病在牛群體的所有年齡段都會發生，但主要發生在幼小年齡段[1]。其主要臨床癥狀為引起患病牛體溫升高、體表淋巴結腫大、眼結膜黃染、貧血等[2]。環形泰勒蟲病的發生具有一定的季節性且多呈急性經過，由于其較高的發病率和死亡率給養牛業帶來了巨大的經濟損失[3]。該病在新疆地區作為一種常見多發的疾病[4-7]，嚴重地制約了當地以牛為主的畜牧業的發展。位于吐魯番地區的托克遜縣是新疆地區農牧業資源豐富的地區之一，據統計托克遜縣牛存欄量為2.56萬頭，并且當地的畜牧業仍在不斷地發展中[8]。位于阿勒泰地區的富蘊縣曾經是新疆三大畜牧縣之一，目前仍是重要的畜產品基地，據2011年統計數據顯示，當地的牲畜數量為100.97萬頭[9]。本次試驗選擇新疆吐魯番和阿勒泰主要奶牛產區中的托克遜縣和富蘊縣為試驗點，通過PCR方法檢測環形泰勒蟲在不同地區、不同品種牛等分組中的感染情況，并利用Tams1基因構建系統進化樹。旨在為托克遜縣和富蘊縣2個地區的牛環形泰勒蟲病的防控工作提供流行病學參考數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 樹脂型基因組DNA提取試劑盒，購自北京鼎國生物技術有限責任公司；瓊脂糖、DL-2 000 marker、核酸染料(GelStain)、2×EasyTaq?PCR Super Mix，均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 PCR儀(型號:BIORAD T100)、紫外凝膠成像儀(型號:Gel Doc2000)，均由美國Bio-Rad公司生產；核酸電泳儀(型號:DYCP-31DN)，由北京六一生物科技有限公司生產。

1.3 樣品采集 本試驗從吐魯番地區的托克遜縣(n=30)和阿勒泰地區的富蘊縣(n=50)共采集牛全血樣品80份，將每份牛全血樣品收集到裝有EDTA-K2的5 mL抗凝管中，并按照不同地區、不同性別、不同年齡段、不同品種對采集的牛全血樣品進行分組。為保證血液樣品質量，每支抗凝管中收集的血液體積不超過抗凝管總容積的2/3，經溫和顛倒混勻后放置于4 ℃環境中，帶回實驗室進行后續試驗。本次試驗所采集的牛全血樣品信息見表1。

表1 托克遜縣和富蘊縣牛全血樣品采集信息Table 1 Collection information of whole bovine blood samples in Toksun county and Fuyun county (份)

1.4 試驗方法

1.4.1 環形泰勒蟲PCR檢測 按照樹脂型基因組DNA提取試劑盒說明書提取牛全血基因組DNA，并在-20 ℃環境中保存備用。參照文獻[10]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成可檢測環形泰勒蟲的Tams1基因特異性引物(上游引物序列:5′-GTAACCTTTAAAAACGT-3′，下游引物序列:5′-GTTACGAACATGGGTTT-3′)。運用PCR方法進行環形泰勒蟲檢測，PCR擴增體系：2×EasyTaq?PCR Super Mix 12.5 μL，上游和下游引物各1 μL，牛全血DNA模板1 μL，并加入9.5 μL超純水將體系補充至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃再延伸10 min，擴增結束后取5 μL PCR產物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。挑選出驗證結果顯示陽性的環形泰勒蟲PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.2 環形泰勒蟲系統進化分析 將本試驗測序獲得的托克遜縣和富蘊縣2個地區的環形泰勒蟲Tams1基因序列通過DNAMAN軟件進行同源性分析，并與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中所上傳的相關序列進行BLAST比對。從BLAST比對結果中篩選出不同地區的環形泰勒蟲Tams1基因序列，利用貝葉斯方法進行系統進化分析。

1.5 統計分析 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析，使用卡方檢驗進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 環形泰勒蟲Tams1基因的PCR檢測 通過PCR擴增得到大小約為721 bp的特異性條帶(圖1)，與預期的目的片段大小相符。

圖1 托克遜縣和富蘊縣部分血液樣品環形泰勒蟲PCR檢測結果Fig.1 PCR results of Theileria annulata in some blood samples of Toksun county and Fuyun countyM： DL-2 000 maker； P： 陽性對照； 1～3： 托克遜縣環形泰勒蟲陽性DNA樣品； 4～6： 富蘊縣環形泰勒蟲陽性DNA樣品M:DL-2 000 maker; P: Positive control; 1-3: Positive DNA samples of Theileria annulata from Toksun county; 4-6: Positive DNA samples of Theileria annulata from Fuyun county

2.2 環形泰勒蟲感染情況 通過PCR方法檢測出托克遜縣和富蘊縣2個地區的牛感染環形泰勒蟲的總感染率為31.25%(25/80)。在以不同地區為分組時，托克遜縣的環形泰勒蟲感染率最高，為40.00%(12/30)，富蘊縣最低，為26.00%(13/50)；在以性別為分組時，環形泰勒蟲感染率在公牛中最高，為36.84%(7/19)，在母牛中最低，為29.51%(18/61)；在以不同年齡為分組時，環形泰勒蟲感染率最高出現在1～3歲的牛群體中，其感染率為50.00%(18/36)，在7～9歲的牛群體中最低，為6.67%(1/15)；在以不同品種為分組時，雜交品種中環形泰勒蟲感染率最高，為35.71%(5/14)，在荷斯坦牛中最低，為28.89%(13/45)。通過卡方檢驗分析發現，環形泰勒蟲感染率在不同地區與不同年齡段組內存在顯著性差異(P<0.05)，在性別和不同品種組內不存在顯著性差異(P>0.05)。分析結果見表2。

表2 托克遜縣和富蘊縣環形泰勒蟲在不同分組中的感染情況Table 2 Infection of Theileria annulata in different groups in Toksun county and Fuyun county

2.3 環形泰勒蟲Tams1基因系統進化分析 系統進化分析結果表明，環形泰勒蟲托克遜縣地方株和富蘊縣地方株與河南地方株之間親緣關系較近，與印度、西班牙等地區的環形泰勒蟲地方株之間的親緣關系較遠。基于環形泰勒蟲Tams1基因構建的系統進化樹見圖2。

圖2 基于環形泰勒蟲Tams1基因構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the Tams1 gene of Theileria annulata▲: 本文測定的托克遜縣環形泰勒蟲Tams1基因序列; ●: 本文測定的富蘊縣環形泰勒蟲Tams1基因序列▲: The Tams1 gene sequences of Theileria annulata in Toksun county were determined; ●: The Tams1 gene sequences of Theileria annulata in Fuyun county were determined

3 討論

本試驗通過PCR方法檢測出托克遜縣和富蘊縣2個地區的環形泰勒蟲總感染率為31.25%。其中，托克遜縣環形泰勒蟲感染率為40.00%，該檢測結果低于沙塔爾·卡哈爾等[11]于2013年和何曉東等[12]于2014年所報道的吐魯番地區環形泰勒蟲感染率(51.60%～57.70%)，產生該結果的原因可能是當地加強了對環形泰勒蟲的防控工作。對首次進行環形泰勒蟲檢測的富蘊縣，其環形泰勒蟲感染率(26.00%)低于本次檢測結果中的托克遜縣地區的環形泰勒蟲感染率(40.00%)。本次環形泰勒蟲感染率的檢測結果在以性別為分組時發現，公畜的感染率(36.84%)高于母畜(29.51%)；在以不同年齡段為分組時發現，環形泰勒蟲感染率在1～3歲的牛群體中最高(50.00%)，在7～9歲的牛群體中最低(6.67%)；在以不同品種為分組時發現，環形泰勒蟲感染率在雜交品種最高(35.71%)，在荷斯坦牛中感染率最低(28.89%)。通過卡方檢驗發現，環形泰勒蟲的感染率在不同地區和不同年齡段的分組中存在顯著性差異(P<0.05)，在不同性別和不同品種的分組中不存在顯著性差異(P>0.05)。上述結果表明，環形泰勒蟲在托克遜縣和富蘊縣2個 地區有著不同的流行情況,且1～3歲的牛群體易感染環形泰勒蟲。因此，在實際的牛養殖過程中應該加強對1～3歲牛群體的保護，如有經臨床診斷確診為由環形泰勒蟲感染而導致牛患病時，應及時采用有效的治療方法[2,13-16]進行治療。

在利用環形泰勒蟲Tams1基因序列[17]進行遺傳進化分析時發現，環形泰勒蟲托克遜縣地方株和富蘊縣地方株與河南地方株間親緣關系較近，但與印度、西班牙等其他地區的環形泰勒蟲地方株間親緣關系較遠。產生上述結果的原因可能是由于本次試驗有限的Tams1基因序列樣本數量所導致的。因此，對于2個不同地區的環形泰勒蟲地方蟲株間的親緣關系有待進行更深層次的研究。