無菌接產培育 SPF 級比格犬

王 旭 ， 王可洲 ， 胡 軍 ， 李方正 ， 王冬冬 ， 郭中坤 ， 雷 戰 ， 楊宗統 ， 齊昊南 ， 原昆鵬 ， 齊佳欣 ， 胡靜雷 ， 時啟琳 ， 尹 月 ， 王建琳 ， 尹燕博

(1. 青島農業大學動物醫學院 ， 山東 青島 266109 ； 2. 山東省實驗動物中心 ， 山東 濟南 250002 ； 3. 上海農林職業技術學院 ， 上海 楊浦 201699 ； 4. 青島博隆實驗動物有限公司 ， 山東 青島 266200 ； 5. 山東省中醫藥研究院 ， 山東 濟南 250031 ； 6.延邊大學農學院 ， 吉林 延吉 133000)

無特定病原(Specific pathogen free,SPF)犬是指除普通級實驗犬應排除的病原外，還不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的病原的實驗犬，是生物醫學特別是獸醫學研究的重要基礎支撐。1946年，Glimstedt 首次培育成無菌犬，隨后 Reece 等在 1968年培育并建立了SPF犬種群[1]。1992年，上海醫科大學實驗動物部利用剖腹產技術培育出6只 SPF 級比格犬[2]，此后未見相關報道。到目前為止，我國尚無SPF犬核心種群，未能實現 SPF 級實驗用比格犬的持續、批量生產。本研究參照培育 SPF 豬所用的無菌接產技術，獲得仔犬轉移至無菌隔離器繼續飼養，成功培育出3批共128 只 SPF 級比格犬。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級種母比格犬24只，年齡2～6歲， 來源于青島博隆實驗動物有限公司[SCXK(魯)20170006]。實驗犬飼養在青島博隆實驗動物有限公司 SPF 動物房內[SYXK(魯)20180026]，溫度：23～25 ℃，濕度：50%～65%，12 h 光照 12 h 黑暗。所有操作均符合實驗動物福利要求，并給予實驗動物人道關懷。

1.2 試劑、物品與儀器 犬細小病毒抗體(CPV-Ab)、犬瘟熱病毒抗體(CDV-Ab)、犬腺病毒抗體(CAV-Ab)、犬冠狀病毒抗體(CCV-Ab)、犬副流感病毒抗體(CPIV-Ab)、犬皰疹病毒抗體(CHV-Ab)ELISA 檢測試劑盒，均購自美國 XpressBio 公司；狂犬病毒抗體(RV-Ab)、弓形蟲抗體(TOX-Ab)ELISA 檢測試劑盒，均購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；鉤端螺旋體抗體(LEP-Ab)ELISA 抗體檢測試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司；布魯氏菌試管凝集抗原，購自中國疾病預防控制中心。HT-1505A 型正壓隔離器為深圳市泓騰生物科技有限公司產品；LDZM-80L-Ⅲ型高壓蒸汽滅菌器為上海申安醫療器械廠產品。復合微生物 B 粉、維生素 C 粉為濟南新星飼料有限公司產品；全價配方奶粉為美國PetAg 公司產品。

1.3 種犬選擇、病原微生物檢測及孕期管理 種犬的選擇標準：備選種犬遺傳背景清楚，母犬年齡2～6歲，公犬年齡2～7歲，中小體型，無難產史。歷史平均窩產仔數不少于 6 只，且健康成活。通過檢測，不攜帶《實驗動物 微生物學等級及監測》(GB 14922.2—2011)和《實驗動物 寄生蟲學等級及監測》(GB 14922.1—2001)中規定的病原[3-4]，臨床健康且品相較好。

種犬采用碩騰公司生產的衛佳捌?疫苗進行免疫，通過自然交配進行配種，種母犬轉入屏障環境之前檢測病原。檢測合格的種母犬懷孕后，轉到經過徹底消毒的欄舍單獨飼養，并保持嚴格消毒。預產期前5天，轉移至屏障環境中適應環境。

1.4 隔離器、屏障環境及用具消毒 由青島博隆實驗動物有限公司與深圳市泓騰生物科技有限公司聯合研制的新型 SPF 犬專用飼養隔離器，為雙箱體構造，每個箱體可飼養 4～8 只幼犬，且箱體之間互不連通。隔離器上、下連接部分采用水封的方式密閉，內置網床、料盆，四周帶有長臂軟質膠手套。使用前先清潔各組件，按照正確的順序組裝隔離器。采用甲醛高錳酸鉀熏蒸方式對隔離器及屏障環境進行消毒，消毒之前先對隔離器的密閉性進行檢查[5]。將所需物品全部放入屏障環境后，每立方米用甲醛42 mL、高錳酸鉀21 g混勻熏蒸24 h后通風3 d備用[6]。保溫轉運箱用1%過氧乙酸溶液噴霧消毒60 min，奶瓶、料盆、手套、洗耳球、手術剪等用2%過氧乙酸浸泡消毒30 min后通風24 h備用[7]。所需墊布和衣物等經121 ℃、110 kPa高壓滅菌20 min后烘干備用。

1.5 無菌接產 母犬轉入屏障環境之前，用0.2%新潔爾滅對其進行全身清洗消毒。母犬轉移到屏障環境后每天用1%聚維酮碘帶犬消毒欄舍1次。母犬有分娩預兆前再次對母犬進行消毒，尤其注意會陰部及后軀、口腔消毒。用開殖器打開母犬陰道，再用麥氏鉗夾住經0.1%新潔爾滅浸泡過的海棉反復幾次消毒陰道。用硫酸卡那霉素噴鼻，每側鼻孔3 mL[8]。接產人員事先用消毒液浸泡雙手，待母犬分娩時迅速將仔犬放置在消毒好的墊巾上，用洗耳球吸出仔犬口腔及鼻腔內液體并結扎、消毒臍帶，隨后將仔犬浸泡在 0.1%新潔爾滅溶液中浸泡消毒。仔犬消毒體表后用滅菌墊布擦干，涂布接生粉后即放入保溫轉運箱中并盡快通過氣閘轉移到無菌隔離器中[9-11]，每個隔離器飼養 4～8 只，不同母犬所生仔犬不能混合放置。

1.6 仔犬的飼養管理 隔離器內溫度第1周為34～35 ℃， 以后每周降低 2 ℃，到 24～26 ℃為止[12]。隔離器內壓力維持在 100～120 Pa,濕度在 40%～70%，換氣次數為30次/h。采用全人工哺乳的方式喂養仔犬，奶粉濃度按照說明書調配。仔犬自出生6 h后開始哺乳，哺乳量根據仔犬的食欲及腹圍確定，不能喂至全飽。仔犬不同日齡每日哺乳次數及哺乳量見表1。哺乳期內每次哺乳后用滅菌棉球擦拭犬的肛門及外陰，促使其排便、排尿，并且每日稱重，測量體長。仔犬 30 日齡開始飼喂高壓滅菌的全價顆粒犬糧，飼喂時將犬糧搗碎并配合適量復合維生素 B 及維生素 C。仔犬 35 日齡開始斷奶，之后每日飼喂 4 次，同時給予煮沸滅菌的溫水。仔犬飼喂過程嚴格按照程序操作，飼喂結束后對傳遞倉、奶瓶等物品進行消毒，切斷病原傳播途徑，確保仔犬健康成活。

表1 SPF 仔犬不同日齡哺乳次數及每次哺乳量Table 1 Breastfeeding frequency and breastfeeding volume of SPF puppies at different ages

1.7 病原檢測種類及方法 除《實驗動物 微生物學等級及監測》(GB 14922.2—2011)和《實驗動物 寄生蟲學等級及監測》(GB 14922.1—2001)中規定的 SPF 犬需凈化的15種病原之外[3-4]，對規模化養殖犬廠危害較大的犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌進行檢測。

采集24只所選種母犬的毛發、糞便拭子及口鼻拭子，無菌采集種母犬血清。于仔犬 2月齡時采集毛發、糞便拭子及口鼻拭子，無菌采集仔犬血清[2]。將待檢樣本送至山東省實驗動物中心，按照《實驗動物 微生物學等級及監測》(GB 14922.2—2011)和《實驗動物 寄生蟲學等級及監測》(GB 14922.1—2001)中規定的檢測方法進行檢測[3-4]，對于國標規定之外的病原自行檢測。病原檢測方法見表2。病毒檢測引物見表3。

表2 SPF 仔犬和種母犬病原及抗體檢測方法Table 2 Pathogens and antibody detection methods of SPF puppies and breeding dogs

表3 病毒檢測引物Table 3 Primers for virus detection

2 結果

2.1 種母犬及SPF犬病原檢測 對符合標準的24只 種母犬進行無菌接產，共獲得仔犬 141 只，1月齡仔犬成活個數為 128 只，成活率為 90.78%。種母犬及仔犬病原檢測結果均為陰性，見表4。

表4 種母犬及 SPF 仔犬抗原檢測結果Table 4 Pathogen test results of breeding female dogs and SPF puppies

2.2 隔離器飼養與普通飼養比格犬生長指標對比分析 分別測量 20 只普通環境飼養的與128只無菌接產隔離器飼養的比格犬 0、10、20、30、40、50、60日齡 生長發育各項指標，結果如表5所示。

表5 隔離器飼養與普通飼養的比格犬生長指標對比Table 5 Comparison of growth indicators of beagle dogs fed in isolators and in ordinary environment

3 討論

早在 20 世紀 60年代，人們就普遍認識到 SPF 動物對于生物醫學研究的重要性[20]，美國、日本、荷蘭等國家先后培育出 SPF 犬核心種群[21-23]。我國 SPF 犬培育工作起步較晚，直到 1992年才開始探索[2]。目前國際上獲得初代 SPF 犬的方法，僅見剖腹取胎法。而初代SPF 豬的獲取方法，則有自然分娩、早期隔離式斷奶技術(SEW)、子宮切開、子宮切除、胚胎移植、無菌接產等[11,24]。自然分娩和早期隔離式斷奶方式操作簡單，對母犬損傷小，但是不能完全切斷來自母犬的污染。子宮切開、子宮切除可以較好地控制來自環境和母犬的污染，但是對母犬損傷太大，不符合動物福利要求，且切除子宮的母犬不能再利用，成本較高。無菌接產法操作相對簡單，對母犬損傷小，且母犬可以重復利用，更加符合動物福利要求。無菌接產操作過程需注意以下兩點：一是母犬分娩的時間不易準確判斷，一旦接產人員錯過接產時間，母犬所產仔犬則不能利用;二是母犬產程較長，對母犬和屏障環境的消毒及接產人員素質要求較高。一旦消毒不徹底，容易造成來自環境和母犬的污染。本研究最終選擇無菌接產方式獲得 SPF 仔犬。研究結果表明，無菌接產隔離飼養的比格犬可以排除國標規定的15種病原，以及犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌等本研究項目規定的病原。

SPF級動物生產過程中，質量控制最為關鍵。本研究采用新型研制的 SPF 犬專用飼養隔離器，隔離器內各項參數由電腦自動監控。隔離器外部亦為屏障環境，其建造要求和參數符合GB50447—2008《實驗動物設施建設技術規范》及 GBl4925—2010《實驗動物環境及設施》的規定[25-26]。設施設備啟用前進行嚴格的消毒，檢測合格之后方可投入使用。日常生產管理中需要建立、健全各項管理制度和操作規程，進入設施內物品須嚴格消毒，定期對內外屏障環境進行消毒。此外，還要對動物定期進行檢測，及時淘汰病原或抗體陽性犬只。

仔犬的生長發育與生產方式、乳品質量、斷奶日齡、飼養管理、飼料營養成分、生活環境等諸多因素有關。本研究通過無菌接產獲得仔犬，由于缺乏初乳及哺乳時間較長，加之仔犬生活在潔凈環境中，難以建立起普通環境中的腸道菌群，導致SPF仔犬生長發育各項指標均低于普通環境下飼養的仔犬。此外，SPF仔犬生活空間狹小，缺乏有效的鍛煉，這也是其較之普通環境下飼養的仔犬體型小的原因。

目前為止，我國尚無一家單位可穩定、批量提供SPF級比格犬，這種狀況嚴重影響了犬疫病研究、疫苗研發及評價工作，對人獸共患病的防制極為不利。本研究通過對母犬進行高強度免疫凈化病原，通過無菌接產獲得SPF仔犬，將其飼養在正壓屏障系統中的無菌隔離器中，同時對環境、用具、飼料、飲水等進行嚴格的控制。病原及抗體檢測結果表明，本方法生產的SPF仔犬，完全達到并優于國標要求，可用于SPF犬的批量生產及SPF犬核心種群的建立。本研究所建立的配套技術及生產的產品，不僅為我國重大動物疫病防控所急需，還將在人類醫學研究特別是新藥研發中得到廣泛應用。