多浪羊發(fā)情周期FSH、LH、P4和E2變化規(guī)律及早期妊娠鑒定

錢 偉 ， 王艷文 ， 布威熱比耶姆·艾力 ， 雷 喬 ， 陳 榮 ， 常衛(wèi)華

(1. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 新疆 阿拉爾 843300 ； 2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 新疆 阿拉爾 843300)

多浪羊是新疆南疆地區(qū)非常優(yōu)良的地方綿羊品種，其肉具有營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)，是我國傳統(tǒng)的食藥兩用且對(duì)人體健康十分有益的肉食品之一[1]，其體內(nèi)含有20多種氨基酸[2]，占人類所需要氨基酸的69.27%。新疆具有獨(dú)特的地理?xiàng)l件及氣候，是我國五大牧區(qū)之一，羊肉年生產(chǎn)量位居第二，因此養(yǎng)殖業(yè)一直都是本地經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要經(jīng)濟(jì)支柱。新疆是一個(gè)多民族聚集地，其中維吾爾族和回族人口較多，因此對(duì)羊肉的需求量更是超過其他地區(qū)。同時(shí)大多數(shù)地區(qū)美食也都離不開羊肉，如羊肉抓飯、烤包子、烤肉等，這些需要優(yōu)良的羊肉作保證； 而且為新疆貧困地區(qū)到2020年實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)脫貧，喀什、和田等地區(qū)正在增加投資力度，加大綿山羊等飼養(yǎng)量。目前，南疆的羊飼養(yǎng)量和肉出口量也在逐漸增加[3]。據(jù)報(bào)道，2013年全疆羊的存欄數(shù)達(dá)3 621萬只，占所有牲畜總存欄數(shù)的68%，到2016年底，存欄數(shù)達(dá)3 915萬只，占總牲畜存欄量的81.9%，所以羊是新疆地區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展最為核心的資源[4]。因此提高多浪羊的繁殖率對(duì)新疆畜牧業(yè)的發(fā)展尤為重要。

羊的需求日益明顯，然而南疆地區(qū)目前飼養(yǎng)技術(shù)及理論的研究相對(duì)比較滯后，胚胎移植、人工輸精、早期斷奶等快繁技術(shù)并沒有全面的推廣，為加快技術(shù)的推廣及理論研究，達(dá)到高效擴(kuò)繁、幫助貧困人群實(shí)現(xiàn)早日脫貧的目的，本試驗(yàn)選擇成年多浪羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其進(jìn)行早期妊娠鑒定，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)分析母羊發(fā)情周期生殖激素的變化規(guī)律，為胚胎移植、胚胎體外生產(chǎn)、生殖生理等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)，以達(dá)到提高多浪羊繁殖效率和生產(chǎn)效益的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 篩選已生產(chǎn)2胎的多浪羊32只，體重(55±7)kg，布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。試驗(yàn)前在隔離欄中隔離45 d，觀察其健康狀態(tài)并做相應(yīng)的驅(qū)蟲。隔離之后，確定32只羊均為健康羊只，而后進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，每天給予全價(jià)飼料并保障飲水充足。

1.2 主要材料及儀器 孕激素陰道栓(CIDR)，購自新西蘭CHH Plastic Moulting Co 公司；注射用血促性素(PMSG)、氯前列醇鈉(PG)，均購自寧波第二激素廠；孕酮(P4)、雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。多功能微孔板檢測(cè)儀，購自美國伯騰儀器有限公司；獸用便攜式B型超聲診斷儀，購自北京坤泰德醫(yī)療科技有限公司；其他常規(guī)耗材及試劑，均購自新疆天翼灃生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的處理 試驗(yàn)羊試驗(yàn)前進(jìn)行45 d的預(yù)飼，期間做常規(guī)驅(qū)蟲、觀察2～3個(gè)發(fā)情周期。保證每天有充足的飲水，并且水源清潔；及時(shí)打掃羊圈衛(wèi)生，盡量避免因環(huán)境衛(wèi)生及飼喂而引起的應(yīng)激。

試驗(yàn)采用CIDR+ PMSG+ PG法對(duì)試驗(yàn)?zāi)秆蜻M(jìn)行同期發(fā)情，放栓當(dāng)天記為第0天，第13天撤栓，同時(shí)注射PG和PMSG，48 h后每天進(jìn)行2次發(fā)情鑒定，發(fā)情的羊進(jìn)行自然交配，交配后第1天為妊娠期第1天。

1.3.2 血液的采集 試驗(yàn)?zāi)秆蚍譃锳(1～16)、B(17～32)兩組，為減少試驗(yàn)誤差，每次采血均在北京時(shí)間18:00。同期發(fā)情放栓當(dāng)天記為第0天，每組羊隔1天采血1次，最后將二者數(shù)據(jù)合并。

1.3.3 激素的測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 用ELISA酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定激素含量，具體步驟按試劑盒說明書操作要求進(jìn)行。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(X)，OD值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)實(shí)際測(cè)定的OD值查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)獲得激素濃度。

1.3.4 早期妊娠的鑒定 試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)情期結(jié)束17 d后， 在妊娠期每隔1周用B超進(jìn)行直腸觀察，分析試驗(yàn)動(dòng)物妊娠情況。

2 結(jié)果

2.1 多浪羊同期發(fā)情下FSH、P4、E2和LH的濃度測(cè)定

2.1.1 同期發(fā)情下FSH測(cè)定 同期發(fā)情中，F(xiàn)SH濃度變化范圍為(13.61±2.28)～(29.01±6.15)IU/L，平均濃度在(18.53±6.96) IU/L。第0天的濃度在(14.89±5.25)IU/L，第16 天的濃度在(29.1±6.15)IU/L，達(dá)到最高值，即發(fā)情前FSH濃度開始顯著升高，排卵前達(dá)最大值，之后FSH濃度迅速下降，發(fā)情后期(第18天)的濃度為(15.3±2.28)IU/L，在整個(gè)發(fā)情周期中FSH處于較低水平，呈脈沖式分泌(圖1)。

圖1 FSH濃度變化趨勢(shì)Fig.1 The change trend of FSH concentration注： 放栓當(dāng)天記為第0天; 下圖同Note: The day the suppository was placed was recorded as day 0. The same as below

2.1.2 同期發(fā)情下LH測(cè)定 同期發(fā)情中，LH濃度變化范圍為(0.3±0.04)～(6.13±0.61)ng/L。第12天之前LH濃度一直處在較低水平，在第6～8天有1個(gè)小的波峰，從第12天開始升高，第16天達(dá)最高值，隨后迅速下降，直到最低水平，變化趨勢(shì)見圖2，和FSH相一致。

2.1.3 同期發(fā)情下P4測(cè)定 同期發(fā)情周期中，P4濃度變化范圍為(18.44±9.38)～(50.80±3.89)pmol/L。第8天開始濃度快速升高，第9、10、11天的濃度達(dá)最大值(50.80±3.89)pmol/L，在整個(gè)同期發(fā)情周期中，P4從第0～8天濃度處于較低水平，第12天以后又逐漸下降，直到降至最低水平，變化趨勢(shì)見圖3。

圖3 P4濃度變化趨勢(shì)Fig.3 The change trend of P4 concentration

2.1.4 同期發(fā)情下E2測(cè)定 同期發(fā)情周期中，E2濃度變化范圍為(16.76±1.14)～(58.68±5.46)ng/L，第10天之前E2濃度一直處在較低水平，從第11天濃度逐漸增加，第15天達(dá)到最大值，隨后又迅速降低，直到最低水平，變化趨勢(shì)見圖4，和P4大體呈負(fù)相關(guān)。

圖4 E2濃度變化趨勢(shì)Fig.4 The change trend of E2 concentration

2.2 早期妊娠鑒定 在對(duì)母羊進(jìn)行妊娠鑒定時(shí)，主要通過直腸探查孕囊，妊娠第19天時(shí)，子宮擴(kuò)張，妊娠第28天時(shí)可清楚的看到孕囊，第35天時(shí)可以清楚的看到較為完整的子葉。見封三彩版圖5。

圖5 早期妊娠診斷Fig.5 The diagnosis of early pregnancyA： 配種后第19天， 紅色箭頭: 擴(kuò)張的子宮； B： 配種后第28天， 綠色箭頭: 羊水，藍(lán)色箭頭: 孕囊； C、D：配種后第35天，黃色箭頭: 子葉A: On the 19th day after mating, red arrow: dilated uterus; B: On the 28th day after mating, green arrow: amniotic fluid, blue arrow: gestational sac; C, D: On the 35th day after mating, yellow arrow: cotyledons

3 討論

3.1 同期發(fā)情期生殖激素變化規(guī)律的比較 FSH在卵泡生長期間可以刺激卵泡繼續(xù)發(fā)育變大，直到接近成熟。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)SH在發(fā)情前期的濃度較高，黃麗波[5]通過對(duì)濟(jì)寧青山羊初情期前至初情期FSH濃度的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)FSH濃度在發(fā)情前期的濃度較高，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。在發(fā)情后期FSH的濃度逐漸減少，邢鳳等[6]對(duì)和田羊和多浪羊初情期內(nèi)FSH分泌變化進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)SH在發(fā)情前期、中期的濃度水平高于發(fā)情后期，且在發(fā)情前期達(dá)到最大值，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

P4在母羊發(fā)情期中具有“啟動(dòng)”作用，能夠刺激卵巢的發(fā)育態(tài)，從而促使母羊再次發(fā)情和排卵[7]。動(dòng)物機(jī)體P4的濃度過高時(shí)，會(huì)抑制E2的分泌，從而能夠?qū)е履秆虿荒馨l(fā)情。在動(dòng)物處于乏情期時(shí)，人為的降低動(dòng)物機(jī)體P4的濃度，能夠?yàn)閯?dòng)物發(fā)情提供前提條件。本試驗(yàn)在整個(gè)發(fā)情周期中P4的濃度變化范圍較小，發(fā)情周期第8天P4開始升高，第13天左右又開始下降，符合P4在動(dòng)物機(jī)體的作用機(jī)制，該試驗(yàn)結(jié)果與黃麗波[5]、賀建寧等[8]的研究結(jié)果相一致。

在發(fā)情開始前1天E2濃度上升，在發(fā)情當(dāng)天達(dá)到峰值，隨后在發(fā)情結(jié)束后，濃度又下降到一個(gè)穩(wěn)定水平。此結(jié)果與Esbenshade等[9]、Magness等[10]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。但是賀建寧等[8]在試驗(yàn)中對(duì)小尾寒羊發(fā)情期E2濃度的變化規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，E2在整個(gè)發(fā)情期其濃度一直處于穩(wěn)定水平，差異性不顯著。

LH在發(fā)情周期的變化規(guī)律呈現(xiàn)脈沖式分泌，在發(fā)情前1天達(dá)到峰值，且僅有1個(gè)高峰值，排卵后迅速下降。這與祁云霞等[11]、王忻等[12]在文獻(xiàn)中所報(bào)道的結(jié)果一致。

3.2 早期妊娠鑒定的比較 在配種后第19天通過B超可以看到子宮擴(kuò)張，子宮內(nèi)有少量液體，第28天可看到孕囊，第35天可清晰的看到子葉。張曉遠(yuǎn)等[13]曾報(bào)道，綿羊早期妊娠的鑒定方法就是能夠清晰地看到子宮小葉圖像；李昊幫[14]通過試驗(yàn)得出，B超能夠在發(fā)情配種后第19～20天確認(rèn)綿羊是否處于妊娠期，在第24天的確診率為81.25%，第32天的確認(rèn)率為93.75%，第37天的確認(rèn)率可達(dá)100%。本試驗(yàn)任務(wù)在配種后的28 d左右進(jìn)行B超的妊娠檢查，可見孕囊，其準(zhǔn)確率較高，本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

試驗(yàn)得出在發(fā)情周期中FSH、LH、P4和E2分泌呈現(xiàn)一定規(guī)律性，其中FSH、LH變化趨勢(shì)相一致，P4和E2變化大致呈負(fù)相關(guān)；通過B超進(jìn)行妊娠鑒定確認(rèn)母羊懷孕的最佳時(shí)間為配種后28 d左右。