雞傳染性貧血病毒與雞細小病毒雙重PCR檢測方法的建立

張艷芳 ， 謝芝勛 ， 鄧顯文 ， 謝志勤 ， 張民秀 ， 羅思思 ， 謝麗基 ， 范 晴 ， 曾婷婷 ， 黃嬌玲 ， 王 盛 , 劉加波

(廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室 ， 廣西 南寧 530001)

雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)可引起3周齡以內的雞嚴重貧血、出血，尤其是骨髓造血組織和胸腺等淋巴組織嚴重萎縮，進而導致雛雞發生免疫抑制[1-3]。雞細小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)屬雞腸道病毒，主要侵害雛雞，可引起以腹瀉、精神抑郁、體溫調節障礙、生長遲緩、營養吸收障礙等為特征的急性或慢性腸道性疾病，與矮小綜合征和營養不良綜合征有關[4-5]，這兩種疾病在雞群中普遍存在，均可引起雛雞發育不良，嚴重危害養雞業的發展，特別是有混合感染時，危害程度尤為明顯，給養雞業造成巨大損失[6]。因此建立有效的檢測方法，加強規模化養雞場對CIAV和ChPV的監測及防控極其重要。多重 PCR可同時檢測和鑒別多種病原體，具有靈敏度高、快速、特異性好等優點，且操作簡易、能實現標準化[7]，在鑒別診斷多種病原混合感染的臨床病例中具有獨特的優勢[8]。本試驗設計了 2 對CIAV和ChPV特異性引物，建立了能夠同時檢測這兩種病毒的雙重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 主要病原體 CIAV、ChPV、禽腎炎病毒(ANV)、禽流感病毒H9亞型(AIV-H9)、雞傳染性喉氣管炎病毒(AILTV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、馬立克病毒(MDV)和大腸桿菌(E.coli)，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 DNA/RNA提取試劑盒、細菌DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、2×TaqPCR Mix，均購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑、pMD 18T Vector、100 bp marker ladder，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器 移液槍，購自法國Gilson公司；生物安全柜，購自美國Baker公司；PCR擴增儀、凝膠成像系統，均購自美國Bio-Rad公司；NanDrop ND-2000 微量核酸檢測儀，購自美國Thermo Fisher公司；高速離心機，購自美國Beckman公司；電泳儀，購自北京六一儀器公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的設計與合成 根據GenBank中CIAV的VP基因和ChPV的NS1基因的保守序列，采用Primer 5.0軟件設計引物和DNASTAR軟件進行比對篩選，通過NCBI的Blast驗證，設計篩選出了2對CIAV和ChPV的特異性引物(表1)。引物由深圳華大基因公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.4.2 DNA/RNA抽提及反轉錄 參照核酸抽提試劑盒說明書抽提CIAV、ChPV、MDV和AILTV 的DNA及ANV、AIV-H9、IBV、NDV和ARV的RNA，將RNA反轉錄成cDNA；同時抽提E.coli的DNA，均保存于-30 ℃ 備用。

1.4.3 反應條件的優化 擴增體系：2×PCR Mix 12.5 μL，CIAV和ChPV的DNA各1 μL作為混合模板，2對引物不同比例共加入2 μL(濃度均為20 μmol/L)，最后用ddH2O補足25 μL。對雙重PCR各引物比例進行優化，選擇最佳比例，再設置梯度PCR選擇最適退火溫度，反應條件：95 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 45 s，退火溫度50.0～60.0 ℃，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 延伸10 min，12 ℃ 保存。PCR產物經濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，拍照保存。

1.4.4 特異性試驗 應用優化的雙重PCR對AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli的核酸進行檢測，同時設陰性對照，評價本試驗建立的雙重PCR方法的特異性。

1.4.5 敏感性試驗 使用NanDrop ND-2000 微量核酸檢測儀測定CIAV和ChPV的核酸濃度，將已知濃度的模板按 10 倍梯度稀釋，逐一進行雙重 PCR 擴增，評估本試驗建立的雙重PCR方法的靈敏性。

1.4.6 臨床樣品檢測試驗 采集自2018年11月—2019年5月廣西南寧地區規模化養雞場的 40 份雞泄殖腔拭子樣品，樣品采集放入含有雙抗的生理鹽水中，置于采樣箱，當日帶回實驗室，進行抽提和反轉錄，應用所建立的雙重PCR方法和普通PCR方法分別進行檢測，試驗重復2次。將目的條帶回收，克隆，挑選陽性菌送至賽默飛廣州分公司進行測序。

2 結果

2.1 反應條件的優化 最佳引物組合比例：CIAV上下游引物各0.4 μL，ChPV上下游引物各0.6 μL(圖1)；最佳退火溫度為56.1 ℃(圖2)；最佳CIAV和ChPV的雙重PCR 反應體系：2×PCR Mix 12.5 μL，2對引物上下游共2 μL，模板混合2 μL，加ddH2O補足25 μL。CIAV和ChPV均可以特異的擴增出相應的目的條帶，無非特異性擴增。

圖1 雙重PCR引物優化試驗結果Fig.1 Primers optimization test results of duplex PCRM:100 bp DNA ladder; N: 陰性對照; 1～9:CIAV引物和ChPV引物分別為0.9～0.1 μL和0.1～0.9 μLM:100 bp DNA ladder; N:Negative control; 1- 9:CIAV primer and ChPV primer were 0.9- 0.1 μL and 0.1- 0.9 μL， respectively

圖2 雙重PCR退火溫度優化試驗結果Fig.2 Annealing temperature optimization test results of duplex PCRM: 100 bp DNA ladder; N: 陰性對照; 1: 50.0 ℃; 2: 50.7 ℃; 3: 51.9 ℃; 4: 53.8 ℃; 5: 56.1 ℃; 6: 58.0 ℃; 7: 59.2 ℃; 8: 60.0 ℃M: 100 bp DNA ladder; N: Negative control; 1: 50.0 ℃; 2: 50.7 ℃; 3: 51.9 ℃; 4: 53.8 ℃; 5: 56.1 ℃; 6: 58.0 ℃; 7: 59.2 ℃; 8: 60.0 ℃

2.2 雙重PCR的特異性試驗 CIAV擴增出219 bp的特異性目的條帶，ChPV擴增出 384 bp 的特異性目的條帶；而AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli均沒有出現特異性條帶(圖3)。

圖3 雙重PCR特異性試驗結果Fig.3 Specificity test results of duplex PCRM:100 bp DNA ladder; N: 陰性對照; 1: CIAV和ChPV; 2: ANV; 3: ChPV; 4: AIV-H9; 5: NDV; 6: ARV; 7: MDV; 8: AILTV; 9: IBV; 10: E.coliM: 100 bp DNA ladder; N: Negative control; 1: CIAV and ChPV; 2: ANV; 3: ChPV; 4: AIV-H9; 5: NDV; 6: ARV; 7: MDV; 8: AILTV; 9: IBV; 10: E.coli

2.3 雙重PCR的敏感性試驗 使用NanDrop ND-2000 微量核酸檢測儀測得CIAV和ChPV的濃度分別為66 ng/μL和78 ng/μL，10倍梯度稀釋后，對各梯度的模板進行檢測。結果表明，本試驗建立的雙重PCR最低能同時檢測到66 fg的CIAV和78 fg的ChPV(圖4)。

圖4 雙重PCR敏感性試驗結果Fig.4 Sensitivity test results of duplex PCRM:100 bp DNA marker; N:陰性對照; 1～9: CIAV 66 ng、6.6 ng、660 pg、66pg、6.6pg、660 fg、66 fg、6.6 fg、0.66 fg和ChPV 78 ng、7.8 ng、780 pg、78 pg、7.8 pg、780 fg、78 fg、7.8 fg、0.78 fgM:100 bp DNA marker; N:Negative control; 1- 9: CIAV 66 ng,6.6 ng, 660 pg, 66 pg, 6.6pg， 660 fg, 66 fg, 6.6 fg,0.66 fg and ChPV 78 ng, 7.8 ng, 780 pg, 78 pg, 7.8 pg, 780 fg, 78 fg, 7.8fg, 0.78 fg

2.4 臨床樣品的檢測 使用所建立的雙重PCR對40份臨床樣品進行檢測，共檢出2份CIAV和ChPV的混合感染、1份CIAV陽性、3份ChPV陽性，重復檢測結果一致，并且與單重PCR檢測及測序方法得出的結果一致，部分臨床樣品檢測結果見圖5。陽性測序結果與相應序列同源性高達96%～99%。

圖5 雙重PCR臨床樣品檢測結果Fig.5 The detection results of clinical samples by duplex PCRM: 100 bp DNA ladder; P: 陽性對照; N: 陰性對照; 1～11: 檢測樣品M: 100 bp DNA ladder; P: Positive control; N: Negative control; 1-11: Samples testing

3 討論

PCR檢測方法具有操作簡易、特異性強、敏感性高、穩定性好等優點。多重 PCR方法，即在一個體系中加入多種引物和模板[9]，1次PCR就能檢測多種病原體，當天就能出結果。建立多重PCR檢測方法關鍵在于引物的設計和篩選，目的片段大小要有合適的梯度，確保產物量相對平衡，目的片段大小相差不宜超過300 bp，各引物退火溫度盡可能相近[10]。本試驗根據CIAV和ChPV的保守基因序列設計和篩選出2對特異性引物，目的條帶大小分別為219 bp和384 bp，通過優化反應條件和體系，確定最佳引物比例分別是CIAV 0.4 μL和ChPV 0.6 μL。設置50.0～60.0 ℃的退火溫度梯度，均能特異地擴增出目的片段，56.1 ℃為本試驗建立的雙重PCR方法最佳退火溫度。

通過CIAV和ChPV雙重PCR的特異性和敏感性試驗，對常見的雞病AIV-H9、MDV、AILTV、IBV、NDV、ARV和E.coli等進行檢測，均沒有出現特異性目的條帶。最低能檢出66 fg CIAV和78 fg ChPV，具有很高的敏感性，完全能夠達到快速檢測這兩種雞病的目的。

利用本試驗建立的CIAV和ChPV雙重PCR檢測方法，對40份臨床樣品進行檢測，與單重PCR和測序得出的結果一致。因此，本試驗建立的雙重PCR 檢測方法適用于CIAV和ChPV混合感染的快速檢測，不僅節約時間、降低成本，還能減少污染，以期為這兩種病毒的防控提供參考。